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[求助]
请教一个western blot的问题，急需答案，谢谢！！！！ 已有20人参与
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在做一个大小为32kDa的蛋白，是abcam的，按照计算的正常上样量，结果如图（已做完内参，没有问题）。怀疑是目的蛋白的表达量不够，增加上样量的结果如图。 实验的大致过程如下 1，电泳 60V(30min),80V（30min）,100V跑到底 2 转膜 半干转，15V（30min）,硝酸纤维素膜 3 封闭 37℃2h,3h,4℃过夜都试过,未发现太大影响（都做不出结果）。 4 一抗 4℃过夜或者37℃2h（根据封闭的时间选择），稀释度是按照说明书上的要求1：1000 5 洗膜 TBST 10min/次×6 6 二抗 37℃1h，稀释度1:5000 7 洗膜 同上 8 显影 ECL暗室处理3min（说明书要求，没问题），照相时的时间选择是5s,200s,50张。 抗体是用PBS稀释（实验室一直都是这么做的），试过用3%BSA稀释，无变化。 小弟已经实在想不出为什么了（快疯），请各位师兄师姐发发慈悲给小弟直条明路吧。  正常上样量  上样量加倍  最大上样量 |
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【答案】应助回帖
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mark也看不清楚，条带能看出有来，感觉就像粘在一起了，是不是电泳时间不够啊，因为这个影响因素较多，你需要一个一个排除。 Western Blot常见问题分析这是个技术贴希望对你分析实验有帮助http://www.bioconsumable.com/cn/tech/2012/4-23/tech_62582186.htm |
23楼2015-01-30 14:09:27
qq705369449
银虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 屏蔽内容, 无应助，字符乱码 2015-01-26 20:10:02
西门吹雪170: 应助指数-1, 屏蔽内容, 无应助，字符乱码 2015-01-26 20:10:02
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2楼2015-01-26 10:43:20
781055707
木虫 (著名写手)
- 应助: 291 (大学生)
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- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
3楼2015-01-26 12:08:14
4楼2015-01-26 14:20:11