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小木虫论坛-学术科研互动平台» 网络生活区» 有奖问答 » 有奖问答中转子版 » 做过western blot 的进来【有效期至08年7月1日】
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meizhou

木虫 (知名作家)

沉墨于心，不没于物

[交流] 做过western blot 的进来【有效期至08年7月1日】

用的2%的BSA 孵育4度摇床隔夜，2%BSA配制的1：500的R&D公司单克隆一抗孵育一个半小时，2%BSA配制的1：5000的金思特公司HRP二抗孵育一个半小时，Amersham的ECL盒子发光。
结果条带非常清晰，但有很多杂条带，原因是什么？一抗、二抗还需要稀释吗 ？ 还是封闭不够 ？

由于抗体比较昂贵，没做过这方面实验的请不要跟帖，谢谢 ！

[ Last edited by meizhou on 2008-6-5 at 21:52 ]
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《memory》---BarbaraStreisand
1楼 2008-06-05 17:11:49
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songshu310

金虫 (小有名气)
★ ★
meizhou(金币+2,VIP+0):tx，我试试这样封闭看
我们这边做，2抗是不能超过一个小时的，另外，不知道 你2抗洗了几次，一般来说多洗几遍比较好，我一般都洗个6，7遍的。
你封闭完了，从冰箱拿出来，在室温下需要放半小时以上的，不知道你是怎样操作的。
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4楼2008-06-06 10:57:04
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xipha

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
meizhou(金币+3,VIP+0):多谢 ！
如果是背景也比较深，可能是曝光过长
非特异条带的话，可能是二抗稀释得不够（浓度过高），也可能是样品本身的问题（膜脂、糖类、浓度等）
另外，国产单抗要看看是什么动物的抗体，不一定就适合你的样品
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2楼2008-06-05 22:26:39
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meizhou

木虫 (知名作家)

沉墨于心，不没于物
引用回帖:
Originally posted by xipha at 2008-6-5 22:26:
如果是背景也比较深，可能是曝光过长
非特异条带的话，可能是二抗稀释得不够（浓度过高），也可能是样品本身的问题（膜脂、糖类、浓度等）
另外，国产单抗要看看是什么动物的抗体，不一定就适合你的样品

背景还好。我做的是牛骨胳肌的两个抗原，其中一个单抗一抗用的是人抗，二抗是羊抗人；另一个一抗用的小鼠抗体，二抗是羊抗小鼠。二抗用的1：5000照他们公司技术员的方法做的，我觉得是不是有可能我反应时间有点长（室温1.5小时）？或者漂洗时间短 ？还有可能是孵育封闭不够，我是4度，2%BSA隔夜的（或者浓度不够？）。
多谢您的帮助 ！

[ Last edited by meizhou on 2008-6-6 at 00:14 ]
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《memory》---BarbaraStreisand
3楼2008-06-06 00:01:54
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