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meizhou

木虫 (知名作家)

沉墨于心,不没于物

[交流] 做过western blot 的进来【有效期至08年7月1日】

用的2%的BSA 孵育4度摇床隔夜,2%BSA配制的1:500的R&D公司单克隆一抗孵育一个半小时,2%BSA配制的1:5000的金思特公司HRP二抗孵育一个半小时,Amersham的ECL盒子发光。
结果条带非常清晰,但有很多杂条带,原因是什么?一抗、二抗还需要稀释吗 ? 还是封闭不够 ?

由于抗体比较昂贵,没做过这方面实验的请不要跟帖,谢谢 !

[ Last edited by meizhou on 2008-6-5 at 21:52 ]
《memory》---BarbaraStreisand
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xipha

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
meizhou(金币+3,VIP+0):多谢 !
如果是背景也比较深,可能是曝光过长
非特异条带的话,可能是二抗稀释得不够(浓度过高),也可能是样品本身的问题(膜脂、糖类、浓度等)
另外,国产单抗要看看是什么动物的抗体,不一定就适合你的样品
2楼2008-06-05 22:26:39
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meizhou

木虫 (知名作家)

沉墨于心,不没于物

引用回帖:
Originally posted by xipha at 2008-6-5 22:26:
如果是背景也比较深,可能是曝光过长
非特异条带的话,可能是二抗稀释得不够(浓度过高),也可能是样品本身的问题(膜脂、糖类、浓度等)
另外,国产单抗要看看是什么动物的抗体,不一定就适合你的样品

背景还好。我做的是牛骨胳肌的两个抗原,其中一个单抗一抗用的是人抗,二抗是羊抗人;另一个一抗用的小鼠抗体,二抗是羊抗小鼠。二抗用的1:5000照他们公司技术员的方法做的,我觉得是不是有可能我反应时间有点长(室温1.5小时)?或者漂洗时间短 ?还有可能是孵育封闭不够,我是4度,2%BSA隔夜的(或者浓度不够?)。
多谢您的帮助 !

[ Last edited by meizhou on 2008-6-6 at 00:14 ]
《memory》---BarbaraStreisand
3楼2008-06-06 00:01:54
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songshu310

金虫 (小有名气)

★ ★
meizhou(金币+2,VIP+0):tx,我试试这样封闭看
我们这边做,2抗是不能超过一个小时的,另外,不知道 你2抗洗了几次,一般来说多洗几遍比较好,我一般都洗个6,7遍的。
你封闭完了,从冰箱拿出来,在室温下需要放半小时以上的,不知道你是怎样操作的。
4楼2008-06-06 10:57:04
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