应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助PCR扩增不出来的问题.....
53/1返回列表
查看: 2082  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

芕星悦

新虫 (小有名气)

[求助] 求助PCR扩增不出来的问题..... 已有11人参与

最近做分子实验PCR，总是做不出来，不知道哪位大侠能够指点一下....

PCR反应总体系为20 ul，其中包含：
DNA（10 ng/ul） 3ul ；
Primers（2 uM）上下游各3ul；
Taq酶（5U/ul） 0.2ul；
dNTP（1mM） 4ul ；
10Xbuffer（含Mg2+，1Xbuffer中含2mM） 2ul；
ddH2O补齐至20ul。

该体系用做扩增叶绿体DNA时，完全没问题，但是在扩增核基因时，仅扩增出一次，就再也没扩增出来了。从扩增效果看，也并不是特别理想。以前做的时候，是用的公司提供的预混液mix，只需加入DNA、primers、Taq，拿水补齐就行了，且扩增结果稳定。现在用同样的扩增程序，可扩增结果怎么都出不来。试了很多次，更换引物（新合成的引物）、增加引物浓度（终浓度为0.3、0.5、1uM的都试过）、更换dNTP、更换DNA、增加DNA模版浓度（体系中30ng、40ng、50ng的都试过），但最终都是无结果。PCR扩增程序没问题的，因为之前用预混液做出来有结果的。只是现在没有条件了，没有再购买预混液了。

另外，不知道水是不是有问题？我做叶绿体基因的时候，扩增结果良好，扩增图谱比较清晰，但用同样的体系，只是更换引物，没有更换水，结果怎么都做不出来了，求大神帮忙.....
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2015-01-21 22:19:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

芕星悦

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 浅语8905 at 2015-02-02 12:34:11
知道是什么原因了吗？

我更换了水，我是尝试的公司里买的水和实验室内纯水仪生产的18.0欧的水，结果就跑出来了。换了水，就要把用前面的水稀释的DNA、dNTP和引物全部更换。
赞一下 回复此楼
22楼2015-02-13 01:53:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 23 个回答

红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们都是模板和引物都是1ul别的没变。不知道你的体系对不对
赞一下 回复此楼
2楼2015-01-21 22:46:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

芕星悦

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2015-01-21 22:46:14
我们都是模板和引物都是1ul别的没变。不知道你的体系对不对

因为引物浓度是2uM的，所以用了3ul，使其终浓度为0.3uM。模版的话30ng应该是足够的。
赞一下 回复此楼
3楼2015-01-22 00:08:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-01-23 13:47:21
引物和模板的浓度看起来是高了，但是如果已经对两者的浓度进行过摸索，还是没有得到结果的话，就可以考虑扩增时酶的问题（普通的Taq酶或者是热启动Taq酶）。
如果采用相同的体系，只是针对不同的DNA模板，其中一个DNA模板扩增完全没有问题，而另一个无论怎样进行体系优化也没有结果，说明问题是在DNA模板本身，是否是降解了，亦或是引物设计不合理，无法扩增。
赞一下 回复此楼
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-01-22 11:04:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 23 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 299求调剂 +3 15188958825 2026-03-25 3/150 2026-03-25 21:07 by JourneyLucky
[考研] 0854AI CV方向招收调剂 +4 章小鱼567 2026-03-23 4/200 2026-03-25 17:04 by CoderLoser
[考研] 085602 289分求调剂 +7 WWW西西弗斯 2026-03-24 7/350 2026-03-25 14:28 by 3Strings
[考研] 281求调剂 +4 Koxui 2026-03-24 5/250 2026-03-25 11:38 by userper
[考研] 287求调剂 +10 晨昏线与星海 2026-03-19 11/550 2026-03-25 10:35 by userper
[考研] 318求调剂 +5 plum李子 2026-03-21 8/400 2026-03-25 09:26 by aa331100
[考研] 材料调剂 +6 匹克i 2026-03-23 6/300 2026-03-24 21:09 by greychen00
[考研] 调剂 +4 13853210211 2026-03-24 4/200 2026-03-24 19:44 by ms629
[考研] 一志愿211 初试270分 求调剂 +5 谷雨上岸 2026-03-23 6/300 2026-03-24 16:32 by laoshidan
[考研] 300求调剂，材料科学英一数二 +5 leaflight 2026-03-24 5/250 2026-03-24 16:25 by laoshidan
[考研] 279分求调剂 一志愿211 +18 chaojifeixia 2026-03-19 20/1000 2026-03-24 10:34 by dolphin_ycj
[考研] 一志愿华东理工大学081700，初试分数271 +5 kotoko_ik 2026-03-23 6/300 2026-03-24 10:29 by 学术搬砖er
[考研] 一志愿河北工业大学0817化工278分求调剂 +7 jhybd 2026-03-23 12/600 2026-03-24 09:03 by jhybd
[考研] 276求调剂。有半年电池和半年高分子实习经历 +9 材料学257求调剂 2026-03-23 10/500 2026-03-24 07:36 by wangy0907
[考研] 一志愿陕师大生物学071000，298分，求调剂 +3 SYA！ 2026-03-23 3/150 2026-03-23 19:09 by macy2011
[考研] 材料学硕301分求调剂 +7 Liyouyumairs 2026-03-21 7/350 2026-03-21 22:31 by peike
[考研] 0703化学调剂 +4 妮妮ninicgb 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:39 by 学员8dgXkO
[考研] 330求调剂0854 +3 assdll 2026-03-21 3/150 2026-03-21 13:01 by 搏击518
[考研] 求调剂 +6 Mqqqqqq 2026-03-19 6/300 2026-03-21 08:04 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +3 eation27 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:32 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭