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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 实验设计与设计方法
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Jay奏依然

金虫 (著名写手)

[求助] 实验设计与设计方法 已有1人参与

背景：A基因敲除小鼠与C57 control。
1.A基因敲除小鼠后表现为E基因mRNA水平下降
2.E基因的转录激活是靠B转录因子和C转录因子及D转录共激活因子形成复合物binding到E基因promoter激活转录
3.实验已证明A蛋白与B转录因子及D转录共激活因子是binding的。

请教接下来实验该怎么设计及好的实验方法？？？


我想做A基因敲除对B转录因子与E基因启动子结合的情况？ 所以请教一下肝组织CHIP的要点及注意事项？
谢谢！！！
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我在，理想在！
1楼 2015-01-19 17:10:22
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BioChen

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Jay奏依然 at 2015-01-20 08:59:01
您好！！！谢谢您的建议，我的目的是想把文章做大点。关于你说的第一点已经做过，没有binding。关于第二点A基因质粒过表达在细胞上E的mRNA水平是上升的。请问还有没有好的设计思路？？？好的试验方法？？？有劳了， ...

要把他做大，你想多大？
你这个敲除小鼠还有很好的表型，才有大文章的可能哦。否则，撑死了JBC。也许你做一大堆实验，JBC也发不了。
有钱没？有钱的话，做个转录组分析呗，瞬间你的文章高大上了。
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4楼2015-01-20 09:06:35
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-01-20 08:34:11
Jay奏依然: 金币+10, ★有帮助 2015-01-20 09:00:12
你的故事应该是A通过结合B、D一起通过调控E的启动子区域下调E的转录。如果还想讲更多故事呢，你要多看点关于A、B、C、D、E的文献，看看是否还有更有意思的事情。

你想看看是否A蛋白影响B与E基因启动子的结合，是非常正确的。至于ChIP要点和注意事项，你自己百度吧。
简单来讲就是用敲除A和野生型的组织，用B抗体，用实时定量PCR检测E基因启动子，比较。

以目前你提供的信息，我比较感兴趣的问题是：
1、A是否能结合到E的启动子区域，你可以做一个ChIP。简单地讲，就是用A的抗体去拖DNA，用PCR检查，看是否能拖到E的启动子区域序列。
2、A能否直接调控E的转录。过表达A和干扰A，RT-PCR检测E的mRNA水平，Western blot检测蛋白水平。将E基因的启动子区域构建到pGL3质粒上面去和构建去掉E基因启动子区域A结合位点（预测或者查文献）的pGL3质粒，过表达A和干扰A，通过荧光素酶报告实验，检测效果。
上面说的实验用细胞做实验，很容易的。
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2楼2015-01-19 20:08:24
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Jay奏依然

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by BioChen at 2015-01-19 00:08:24
你的故事应该是A通过结合B、D一起通过调控E的启动子区域下调E的转录。如果还想讲更多故事呢，你要多看点关于A、B、C、D、E的文献，看看是否还有更有意思的事情。

你想看看是否A蛋白影响B与E基因启动子的结合，是 ...

您好！！！谢谢您的建议，我的目的是想把文章做大点。关于你说的第一点已经做过，没有binding。关于第二点A基因质粒过表达在细胞上E的mRNA水平是上升的。请问还有没有好的设计思路？？？好的试验方法？？？有劳了，谢谢！！！
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我在，理想在！
3楼2015-01-20 08:59:01
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titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Jay奏依然(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-02-02 20:58:45
你这个结果已经比较全了，再做也只是侧面验证，意义不大，你说看A被knock out，b对e promoter的binding情况，如果你上述结论无误的话，不用试验我就可以告诉你，binding效率低了。
那如果你非要接下去做的话，你去knock out B、c、d都比继续做A要有意义，因为你还不知道复合体中是ABCD哪个或哪几个直接binding在启动子上的，直接结合的没了就彻底binding不了了，其它的只是辅助影响效率。
真正有意义的是打通通路，不是纠结在一个复合体上。
谁调控ABCD？E是干什么的，能调控什么？
打通通路才是大神，做蛋白就只是做蛋白的。。。
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5楼2015-01-20 10:07:13
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