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铜虫 (小有名气)

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[交流] 市面上的假血清实在太多了……Gibco基本上全是假的，支原体太多

前段时间有个同学因为细胞状态不好，培养基里有小黑点，怀疑是支原体污染

。于是检测了一下，果真是的，就买了支原体清除剂。别说效果还真好，3天后细胞状态就好了。

既然细胞状态好了，就停用了，没想到一停用，细胞状态就又差了。把培养箱、细胞房都清理一遍还是不行，就问到了我，既然这些因素都排除了，最后只有一个可能了，刚买的Gibco的胎牛血清，本来心里还想，同学实验室真是土豪啊

，我就问了价格，南美胎牛1500……澳州胎牛血清3000……，

简直惊讶到了，现在Gibco的血清简直是一货难求，澳州胎牛血清已经炒到了8000+了。

就断定这个血清肯定是假的，用检测试剂盒检测了一下，果然是这个问题，假血清真是害人啊，这些无良奸商

……由于支原体比较小，滤器过滤不掉，所以大家买血清的时候一定要先试用，检测一下支原体（现在好多大牌子都会有支原体检测报告）

这里来分享一下支原体检测方法：

1，PCR检测法。
（1）细胞铺24孔板，5x104个/孔；
（2）每隔1d取细胞培养液留样，连取3d；
（3）细胞培养液95℃水浴加热5min，12000rpm离心1min，取上清做下一步的巢式PCR检测；
（4）巢式PCR第一轮体系和程序：
                                                               体系：模板：4步骤所得细胞培养液  2ul
                                                               Primer-F(10mM):                   1ul
                                                               Primer-R(10mM):                   1ul
                                                               dNTP Mixture(10mM each):    1ul
                                                               Taq酶(2u/ul)：                      0.5ul
                                                               10XTaq酶buffer：                   5ul
                                                               H2O:                                     39.5ul
                                                               Total                                     50ul

                                                            程序：    95℃  2min    cycles 1x
                                                                              95℃  20S
                                                                              55℃  20S
                                                                              72℃  2min
                                                                              72℃  6min    cycles 1x
                                                                              4℃ hold
（5）巢式PCR第二轮体系和程序：
                                                            体系：模板：一轮PCR产物       2ul
                                                            Primer-F2(10mM):                   1ul
                                                            Primer-R2(10mM):                   1ul
                                                            dNTP Mixture(10mM each):    1ul
                                                            Taq酶(2u/ul)：                      0.5ul
                                                            10XTaq酶buffer：                      5ul
                                                            H2O:                                  39.5ul
                                                            Total                                     50ul

                                                            程序：    95℃  2min    cycles 1x
                                                                           95℃  20S
                                                                           55℃  20S
                                                                           72℃  1min
                                                                           72℃  6min    cycles 1x
                                                                           4℃ hold
（6） 1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

2支原体检测跑胶图-20084539882.jpg
这个Primers 是依据支原体基因组中高度保守的 16SrRNA 编码域而设计的，只需简单的 PCR 反应就可检测 M.Arginini, M.Fermentans, M.Hyorhinis, M.Orale, M.Salivarium, M. Hominis, M.Pneumonia 等常见的支原体。

2，DNA萤光染色法
利用萤光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。