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铜虫 (小有名气)

[交流] 市面上的假血清实在太多了……Gibco基本上全是假的，支原体太多

前段时间有个同学因为细胞状态不好，培养基里有小黑点，怀疑是支原体污染。于是检测了一下，果真是的，就买了支原体清除剂。别说效果还真好，3天后细胞状态就好了。
   
   既然细胞状态好了，就停用了，没想到一停用，细胞状态就又差了。把培养箱、细胞房都清理一遍还是不行，就问到了我，既然这些因素都排除了，最后只有一个可能了，刚买的Gibco的胎牛血清，本来心里还想，同学实验室真是土豪啊，我就问了价格，南美胎牛1500……澳州胎牛血清3000……，简直惊讶到了，现在Gibco的血清简直是一货难求，澳州胎牛血清已经炒到了8000+了。

   就断定这个血清肯定是假的，用检测试剂盒检测了一下，果然是这个问题，假血清真是害人啊，这些无良奸商……由于支原体比较小，滤器过滤不掉，所以大家买血清的时候一定要先试用，检测一下支原体（现在好多大牌子都会有支原体检测报告）

这里来分享一下支原体检测方法：

1，PCR检测法。
（1） 细胞铺24孔板，5x104个/孔；
（2） 每隔1d取细胞培养液留样，连取3d；
（3） 细胞培养液95℃水浴加热5min，12000rpm离心1min，取上清做下一步的巢式PCR检测；
（4） 巢式PCR第一轮体系和程序：
                                                                 体系：模板：4步骤所得细胞培养液  2ul
                                                                  Primer-F(10mM):                     1ul                 
                                                                  Primer-R(10mM):                    1ul
                                                                  dNTP Mixture(10mM each):     1ul  
                                                                  Taq酶(2u/ul)：                        0.5ul
                                                                 10XTaq酶buffer：                    5ul
                                                                 H2O:                                       39.5ul
                                                                 Total                                        50ul

                                                                程序：       95℃  2min      cycles    1x
                                                                                  95℃  20S
                                                                                  55℃  20S
                                                                                  72℃  2min
                                                                                  72℃  6min      cycles    1x
                                                                                  4℃   hold
（5） 巢式PCR第二轮体系和程序：
                                                               体系：模板：一轮PCR产物         2ul
                                                               Primer-F2(10mM):                      1ul                 
                                                               Primer-R2(10mM):                     1ul
                                                               dNTP Mixture(10mM each):       1ul  
                                                               Taq酶(2u/ul)：                        0.5ul
                                                              10XTaq酶buffer：                       5ul
                                                               H2O:                                     39.5ul
                                                               Total                                       50ul
                                                
                                                              程序：       95℃  2min      cycles    1x
                                                                               95℃  20S
                                                                               55℃  20S
                                                                               72℃  1min
                                                                               72℃  6min      cycles    1x
                                                                               4℃   hold
（6） 1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

市面上的假血清实在太多了……Gibco基本上全是假的，支原体太多
2支原体检测跑胶图-20084539882.jpg
    这个Primers 是依据支原体基因组中高度保守的 16SrRNA 编码域而设计的，只需简单的 PCR 反应就可检测 M.Arginini, M.Fermentans, M.Hyorhinis, M.Orale, M.Salivarium, M. Hominis, M.Pneumonia 等常见的支原体。

2，DNA萤光染色法
    利用萤光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。
市面上的假血清实在太多了……Gibco基本上全是假的，支原体太多-1
MycoplasmaOUT处理细胞前


市面上的假血清实在太多了……Gibco基本上全是假的，支原体太多-2
MycoplasmaOUT处理细胞后

   由于是细胞里用的产品，抗生素类的最好谨慎使用，这里有个之前使用MycoplasmaOUT™，是抗菌肽类型的，处理时间也短，只要3天就可以了，而且对细胞也无毒无害。
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1楼 2015-01-12 15:05:11
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雁山清雪

新虫 (初入文坛)
是的，我的就污染了，黑黑小虫子好恶心，
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2楼2015-01-12 15:22:47
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Catherine92

金虫 (小有名气)
这么恐怖？前两天实验室刚买的胎牛血清。。。。
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3楼2015-01-12 15:27:06
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mlanqiang

木虫之王 (文学泰斗)
★
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blessing
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25楼2015-01-12 15:58:31
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mlanqiang

木虫之王 (文学泰斗)
blessing
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26楼2015-01-12 16:00:12
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dolly8242

木虫 (著名写手)
★
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搞合成的表示看不懂搞生物的...............
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36楼2015-01-12 16:16:35
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jx3551992

银虫 (正式写手)
★
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祝好
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49楼2015-01-12 16:47:40
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dmbb4楼
2015-01-12 15:28   回复  
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假大空5楼
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readytogo7楼
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shcj8楼
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wangyang788712楼
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chenjiantao13楼
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bjb9814楼
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祝福
linkuodong15楼
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springsunyj16楼
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jiaoxg17楼
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张季风21楼
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