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杨瑞雪

金虫 (小有名气)

[求助] 超生破碎大肠杆菌菌液总是会有好多泡沫,蛋白是否因此变性 已有4人参与

各位大牛,小虫最近在纯化蛋白,为了做蛋白与小分子的亲和实验,可是亲和结果不好,怀疑蛋白变性,我在超生破碎的时候,总是会有好多泡沫,看大家也都在说起泡沫会是蛋白质变性,我的菌液是10ml左右,放在40ml的小玻璃烧杯中,再冰浴超生破碎,功率60%,3s超生,10s停顿,40循环,即9min左右,每次都是让探头触到杯底(貌似这种做法是错误的。。。),是不是功率太大了?小虫在此谢过各位了~~
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你所浪费的今天,是昨天已死去的人奢望的明天;你所厌恶的现在,是明天的你回不去的曾经……
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
气泡多了之后蛋白质肯定会有变性,而且如果你的蛋白质有二硫键,你可以用红外、紫外光谱和CD测定一下你的蛋白质与标准品之间是否存较大的差异,也可以测定生物活性,或者用免疫方法,但是为了不损失你的蛋白质样品,推荐用光谱方法。如果真的变性了,加些变性剂然后用透析、超滤除去变性剂,并且稀释,然后在浓缩,一般能够复性,复性也可以光谱检测。如果由二硫键,可以加入巯基乙醇或DTT,然后去除。
2楼2014-12-30 00:34:37
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

你想具体问什么?请你说明白,另外变性的蛋白质样品,你就干脆不要了?
4楼2014-12-30 23:13:29
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letitbe521

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


杨瑞雪: 金币+1, ★★★★★最佳答案, 是我想要的答案,谢谢亲 2015-01-03 14:10:16
蛋白破碎要选合适的探头,探头太粗,液体太少会起泡沫,探头既不能碰壁也不能触底,一般探头处于液体中间,正常的声音是很清脆的那种;功率60%太高了,一般40-45%,破3s,停4s,1-2min完全足够,只要稍微透亮就可以了。还有你要确定纯化出的蛋白是不是你要的,有没有纯化出来
6楼2015-01-02 19:21:08
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普通回帖

杨瑞雪

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-12-30 00:34:37
气泡多了之后蛋白质肯定会有变性,而且如果你的蛋白质有二硫键,你可以用红外、紫外光谱和CD测定一下你的蛋白质与标准品之间是否存较大的差异,也可以测定生物活性,或者用免疫方法,但是为了不损失你的蛋白质样品, ...

谢谢亲的回复,我没有标准品,也不希望蛋白变性,这个蛋白很不稳定,变性后复性太麻烦,也会对后续实验有影响吧~~所以还是要保证纯化出来的蛋白就有活性才好~~~
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3楼2014-12-30 13:36:53
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

你是不是想问不引起变性的蛋白质的分离提出?如果是,我按照这个回答你,如果不是,请你提出,希望和我讨论什么问题?
5楼2014-12-30 23:19:21
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杨瑞雪

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-12-30 23:19:21
你是不是想问不引起变性的蛋白质的分离提出?如果是,我按照这个回答你,如果不是,请你提出,希望和我讨论什么问题?

我想问的是我这样粗犷的破碎菌液是不是会引起蛋白变性,如果是,怎样改变参数?目前我打算降低功率,由于菌液只有10ml,把容器由烧杯换成50ml的离心管,不让探头碰壁,又能插到液面以下,实验室一直用的探头很粗,短时间没法换,只能这样了~~~
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7楼2015-01-03 14:08:52
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杨瑞雪

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by letitbe521 at 2015-01-02 19:21:08
蛋白破碎要选合适的探头,探头太粗,液体太少会起泡沫,探头既不能碰壁也不能触底,一般探头处于液体中间,正常的声音是很清脆的那种;功率60%太高了,一般40-45%,破3s,停4s,1-2min完全足够,只要稍微透亮就可以 ...

谢谢亲的回答,我下次降低一下功率,我的重悬液只有10ml ,探头略粗,以前是用40ml 的那种玻璃小烧杯装的重悬液,冰浴破碎,现在改成50ml 的离心管,我也问了问植物所的同学,同样10ml 的重悬液他们破碎5min,停顿5min,再破碎5min,时间差这么多也无所谓吗?此图是我破碎完成之后的照片
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8楼2015-01-03 14:22:47
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

你不会用使用烧杯直接超的吧,起泡膜原因很多,我之前是因为装液量少,探头太粗导致的,你可以增加装液量,探头一定不能碰壁~
···
9楼2015-12-28 08:45:43
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

还有就是我们一般都用10mL离心管超,效果挺好的
···
10楼2015-12-28 08:46:43
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