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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 超生破碎大肠杆菌菌液总是会有好多泡沫，蛋白是否因此变性
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杨瑞雪

金虫 (小有名气)

[求助] 超生破碎大肠杆菌菌液总是会有好多泡沫，蛋白是否因此变性已有4人参与

各位大牛，小虫最近在纯化蛋白，为了做蛋白与小分子的亲和实验，可是亲和结果不好，怀疑蛋白变性，我在超生破碎的时候，总是会有好多泡沫，看大家也都在说起泡沫会是蛋白质变性，我的菌液是10ml左右，放在40ml的小玻璃烧杯中，再冰浴超生破碎，功率60%，3s超生，10s停顿，40循环，即9min左右，每次都是让探头触到杯底（貌似这种做法是错误的。。。），是不是功率太大了？小虫在此谢过各位了~~
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1楼2014-12-29 21:01:10
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
气泡多了之后蛋白质肯定会有变性，而且如果你的蛋白质有二硫键，你可以用红外、紫外光谱和CD测定一下你的蛋白质与标准品之间是否存较大的差异，也可以测定生物活性，或者用免疫方法，但是为了不损失你的蛋白质样品，推荐用光谱方法。如果真的变性了，加些变性剂然后用透析、超滤除去变性剂，并且稀释，然后在浓缩，一般能够复性，复性也可以光谱检测。如果由二硫键，可以加入巯基乙醇或DTT，然后去除。
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2楼2014-12-30 00:34:37
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
你想具体问什么？请你说明白，另外变性的蛋白质样品，你就干脆不要了？
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4楼2014-12-30 23:13:29
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letitbe521

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
杨瑞雪: 金币+1, ★★★★★最佳答案, 是我想要的答案，谢谢亲 2015-01-03 14:10:16
蛋白破碎要选合适的探头，探头太粗，液体太少会起泡沫，探头既不能碰壁也不能触底，一般探头处于液体中间，正常的声音是很清脆的那种；功率60%太高了，一般40-45%，破3s，停4s，1-2min完全足够，只要稍微透亮就可以了。还有你要确定纯化出的蛋白是不是你要的，有没有纯化出来
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6楼2015-01-02 19:21:08
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普通回帖

杨瑞雪

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-12-30 00:34:37
气泡多了之后蛋白质肯定会有变性，而且如果你的蛋白质有二硫键，你可以用红外、紫外光谱和CD测定一下你的蛋白质与标准品之间是否存较大的差异，也可以测定生物活性，或者用免疫方法，但是为了不损失你的蛋白质样品， ...

谢谢亲的回复，我没有标准品，也不希望蛋白变性，这个蛋白很不稳定，变性后复性太麻烦，也会对后续实验有影响吧~~所以还是要保证纯化出来的蛋白就有活性才好~~~
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3楼2014-12-30 13:36:53
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
你是不是想问不引起变性的蛋白质的分离提出？如果是，我按照这个回答你，如果不是，请你提出，希望和我讨论什么问题？
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5楼2014-12-30 23:19:21
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杨瑞雪

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-12-30 23:19:21
你是不是想问不引起变性的蛋白质的分离提出？如果是，我按照这个回答你，如果不是，请你提出，希望和我讨论什么问题？

我想问的是我这样粗犷的破碎菌液是不是会引起蛋白变性，如果是，怎样改变参数？目前我打算降低功率，由于菌液只有10ml，把容器由烧杯换成50ml的离心管，不让探头碰壁，又能插到液面以下，实验室一直用的探头很粗，短时间没法换，只能这样了~~~
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7楼2015-01-03 14:08:52
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杨瑞雪

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by letitbe521 at 2015-01-02 19:21:08
蛋白破碎要选合适的探头，探头太粗，液体太少会起泡沫，探头既不能碰壁也不能触底，一般探头处于液体中间，正常的声音是很清脆的那种；功率60%太高了，一般40-45%，破3s，停4s，1-2min完全足够，只要稍微透亮就可以 ...

谢谢亲的回答，我下次降低一下功率，我的重悬液只有10ml ，探头略粗，以前是用40ml 的那种玻璃小烧杯装的重悬液，冰浴破碎，现在改成50ml 的离心管，我也问了问植物所的同学，同样10ml 的重悬液他们破碎5min，停顿5min，再破碎5min，时间差这么多也无所谓吗？此图是我破碎完成之后的照片
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8楼2015-01-03 14:22:47
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

你不会用使用烧杯直接超的吧，起泡膜原因很多，我之前是因为装液量少，探头太粗导致的，你可以增加装液量，探头一定不能碰壁~
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···
9楼2015-12-28 08:45:43
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

还有就是我们一般都用10mL离心管超，效果挺好的
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···
10楼2015-12-28 08:46:43
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