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引物PCR 已有4人参与
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| 从质粒上P一个4KB多的片段，下游引物是taatctagaactatagtgagtcg ，CG含量比较低，但也有23个BP，为啥我都把退火温度降到45度了，还是没有条带。我用的酶是Prime STAR MAX |
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【答案】应助回帖
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why025: 金币+10, ★有帮助, 现在倾向于质粒有问题，有poly结构 2015-01-06 22:55:19
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why025: 金币+10, ★有帮助, 现在倾向于质粒有问题，有poly结构 2015-01-06 22:55:19
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质粒模板比较纯，会比其它模板好P。但是你的产物片段较大，也会容易导致扩增失败。失败就有很多种原因了，具体分析如下。 1、延伸时间不够长。一般来说，按1kb/min的速度设置延伸时间，具体可再参考说明书提供的速度。 2、退火温度不合适。退火温度越高，结合到模板的引物越少，特异性越好，产物越少；退火温度越低则相反。用TmUtility软件按Mg 2.5mM计算的话，你的下游引物Tm约54度。考虑到你的电泳条带没有，退火温度可以从54度往下适当降低点温度，比如50度。或者采用Touchdown程序来保证特异性和产物的量。 3、产物的GC含量太高。GC-rich的模板容易形成二级结构导致PCR失败，若GC含量大于70%，可考虑添加适当的DMSO（比如4%）消除这种影响。但加入DMSO，引物的Tm值会有所下降，可用TmUtility软件重新计算Tm值。 4、模板有问题。跑电泳、测OD可观察质粒的浓度、纯度和大小；测序验证质粒的序列是否正确；根据质粒浓度算出拷贝数（一般是10^10 copies/ul左右），稀释为10^5 - 10^8作为模板。 5、其它。酶、引物放太久了，或者仪器坏了。。。这个可能性小一些。 6、实在不行，设计4条引物，把产物分成两段P，再进行重叠延伸、拼接。 |
5楼2014-12-28 15:54:18