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马海云

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专业: 蛋白质组学

[求助] Bac-to-bac杆状病毒表达系统已有4人参与

我最近在用这个系统做蛋白表达，提取杆粒测得DNA浓度也在几百纳克每微升，但转染到细胞后，就是没表达，这是怎么回事呢？可能的原因有哪些？请大家帮忙解答下，万分感谢！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

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1楼 2014-12-22 09:35:29

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dalian0725

新虫 (小有名气)

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引用回帖:

14楼: Originally posted by wangjy108 at 2015-01-12 19:55:21
重组的bacmid浓度确实低，提取之后我们一般用PCR检测，确定目标基因重组上去之后做转染。可以适当延长P1的收毒时间，多培养几天，然后扩增制备P2、P3，使用滴度合适的病毒代次，蛋白表达量低的话可以增加表达体系的 ...

同学，我现在在做用Bac-to-Bac表达蛋白，但是做到提取杆粒转染昆虫细胞sf9的时候就老失败，不知道是哪方面的原因。
我用的载体是pFastBac1，用碱裂解的方法手提杆粒，但是有四五条带，在最下边还有特别亮的RNA带。然后采用脂质体转染Sf9，转染时培养液用的是无抗无血清的Grace培养液。（Grace培养液是有Grace’s insect cell culture medicine粉末，水解乳蛋白，酵母浸出液，碳酸氢钠配制而成）。
你是怎么做的？你觉得我是啥有问题呢？