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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 退火的问题
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xueyutianj

新虫 (小有名气)

[求助] 退火的问题

各位前辈好，

我现在有寡核苷酸链2A和2B，长都是26个碱基，其实2B就是包含了两段13个碱基的重复序列，每段序列命名为B，2A也一样。然后我合成了互补片段A*B*，和B*A*， 长度都是26个碱基，想通过这个互补片段把前面的2A和2B连起来，就是想要连着的AA BB AA ~~~， 用 A*B* B*A* 与之互补配对，形成双链无所谓，希望这条链越长越好，可我现在不知道怎么做退火，试了下，貌似不行。

我的方法是： 取等量的2A 2B A*B* B*A*, 就是从原液里取的（100 uM), 离心管混合后，放到沸水里加热5分钟，然后关掉电磁炉，自然冷却到室温，厂家提供的Tm是38度，室温大概15度。buffer 是10 mM 的TE，外加50mM NaCl

后来电泳结果条带位置很前，貌似是没做出来或者形成的链很短

这个退火对我下一步实验超级超级重要，大家能给我点建议吗？
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1楼 2014-12-03 18:55:10
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cory0931

至尊木虫 (文坛精英)

巫山云
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-04 10:41:06
直接合成长链呗！
要所长合成多长都可以，几百几千的现在也不是太难的事，够你下游试验就行了；
比如说200bp也就是接近8个重复；
或者直接和300bp，在两端加两条引物，合成完了以后做一下PCR，想扩多少扩多少；
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锤之千古
2楼2014-12-03 20:26:08
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xueyutianj

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cory0931 at 2014-12-03 20:26:08
直接合成长链呗！
要所长合成多长都可以，几百几千的现在也不是太难的事，够你下游试验就行了；
比如说200bp也就是接近8个重复；
或者直接和300bp，在两端加两条引物，合成完了以后做一下PCR，想扩多少扩多少；

不是  我是拿DNA 作材料的，我上面讲的只是个类似的设计，事实上我要的DNA长链中间必须每隔一段就得有一段单链，这个单链对我的实验非常重要，所以不能PCR， 合成也合不出这样的，而且我需要的链长至少是1万个碱基。。。。
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3楼2014-12-03 21:53:18
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cory0931

至尊木虫 (文坛精英)

巫山云
引用回帖:
3楼: Originally posted by xueyutianj at 2014-12-03 21:53:18
不是  我是拿DNA 作材料的，我上面讲的只是个类似的设计，事实上我要的DNA长链中间必须每隔一段就得有一段单链，这个单链对我的实验非常重要，所以不能PCR， 合成也合不出这样的，而且我需要的链长至少是1万个碱基 ...

额哦，高精尖啊；
入行了，就慢慢琢磨吧，超出我的范围了；
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锤之千古
4楼2014-12-03 22:46:06
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