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why025

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

cDNA P了多少次了,早不行了吧
21楼2015-01-07 16:42:26
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by dulei at 2014-11-25 20:05:40
PCR对于退火温度的依赖性特别小,只要不是过高的Tm值,上下范围差个10度都能P出了,所以梯度PCR对于目标条带影响不大(会有“亮暗”的小区别,不会引起目标条带“有无”的区别)。

你这种情况,模板可能加的过多 ...

上下10度太多了吧,我上次做的梯度,上下也就差4度,差5度时候就出现了双峰。差更多时候就不只是双峰了,是很多很多的峰。。
22楼2015-01-15 10:59:25
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dulei

木虫 (小有名气)

引用回帖:
22楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2015-01-15 10:59:25
上下10度太多了吧,我上次做的梯度,上下也就差4度,差5度时候就出现了双峰。差更多时候就不只是双峰了,是很多很多的峰。。...

引物设计要设计好,你要保证引物设计的时候跟上下1000范围内没有计算出来的错配,这样退火温度根本可以不用考虑。我们设计的引物,回来后根本不用管Tm值,随便用45-70度任何一个温度,就都能P出来。当然我们会考虑引物长度的问题,如果引物在20bp左右,那么45-60度都能P出来,如果引物超过30bp,那么55-70度都可以P出来。
所以引物设计的好坏是整个PCR有没有非特异性条带的关键所在。
23楼2015-01-15 16:48:12
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sunshine436

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

估计是你的cda降解了,cda应该分装后保存在负80.每次用都拿新的

[ 发自小木虫客户端 ]
24楼2015-01-16 10:04:35
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青柠hsf

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 纤纤陌上尘 at 2014-11-25 16:10:31
我之前一直扩不出来,直到后来25ul体系中加了1ulDMSO,屡试不爽

请教一下前辈,我半年前用同样的事迹P出特别亮的目的条带,现在却经常出现引物二聚体和模板,是否也可以加DMSO?
25楼2015-09-16 22:11:54
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吕木木

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 纤纤陌上尘 at 2014-11-25 16:10:31
我之前一直扩不出来,直到后来25ul体系中加了1ulDMSO,屡试不爽

DMSO是什么,加多少浓度的啊

发自小木虫Android客户端
26楼2016-04-04 22:16:47
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