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铁虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

cDNA P了多少次了，早不行了吧

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21楼2015-01-07 16:42:26

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曼舞流苏

新虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

引用回帖:

9楼: Originally posted by dulei at 2014-11-25 20:05:40
PCR对于退火温度的依赖性特别小，只要不是过高的Tm值，上下范围差个10度都能P出了，所以梯度PCR对于目标条带影响不大（会有“亮暗”的小区别，不会引起目标条带“有无”的区别）。

你这种情况，模板可能加的过多 ...

上下10度太多了吧，我上次做的梯度，上下也就差4度，差5度时候就出现了双峰。差更多时候就不只是双峰了，是很多很多的峰。。

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22楼2015-01-15 10:59:25

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dulei

木虫 (小有名气)

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引用回帖:

22楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2015-01-15 10:59:25
上下10度太多了吧，我上次做的梯度，上下也就差4度，差5度时候就出现了双峰。差更多时候就不只是双峰了，是很多很多的峰。。...

引物设计要设计好，你要保证引物设计的时候跟上下1000范围内没有计算出来的错配，这样退火温度根本可以不用考虑。我们设计的引物，回来后根本不用管Tm值，随便用45-70度任何一个温度，就都能P出来。当然我们会考虑引物长度的问题，如果引物在20bp左右，那么45-60度都能P出来，如果引物超过30bp，那么55-70度都可以P出来。
所以引物设计的好坏是整个PCR有没有非特异性条带的关键所在。

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23楼2015-01-15 16:48:12

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