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aotoulan

禁虫 (小有名气)

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12楼2014-11-25 20:57:28

AQ-Bio-Z

新虫 (初入文坛)

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luchao507(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-26 10:16:31

感觉是模板不行了，你扩下内参看看先

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13楼2014-11-25 20:59:58

hihe99

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从你说的来看，引物的gc含量可能比较低是吧，然后做梯度pcr到42能有带，说明体系是应该没问题的，如果gc含量是比较低的话，可以试试把变性到退火，退火到延伸的升降温速度调低，调到用梯度时花的时间就差不多了，另外，如果引物够长的话退火温度可以不用那么低

14楼2014-11-26 13:45:22

匿名

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15楼2014-11-26 13:55:47

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蓝索道人

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还不是模板浓度太高了？你重复PCR时，模板是怎么加的啊，稀释个50，或者100倍试试

努力就有收获！

16楼2014-11-27 14:45:45

oO晶锅Oo

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如你所说Tm值42℃，只出了一次条带，说明你的引物序列太短，我怀疑它的特异性。分析原因有二：你如果用的是Taq酶扩增没出条带就是酶或者cDNA或者引物水解坏掉了；你如果用的是Pfu酶扩增，很有可能是产物不特异，被酶水解掉了，又或者你先加了引物后加的cDNA导致引物被提前水解。建议：首先去NCBI-Primer BLAST网页确认你的引物与产物的特异性，那里还可以显示引物的Tm值，然后确认cDNA模板、酶保存完好没有水解坏掉。在此前提下，做个梯度PCR来确认退火温度，如果你不能做梯度PCR就用网站给出的Tm值减5-10℃作为退火温度。

17楼2014-11-28 15:47:02

静水流燊

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我觉得可能是模板的问题，我也遇到过，你的RNA是所有组织混合的么，可能没有表达，可以重新反转录一下试试

18楼2014-12-02 16:42:07

Neo2000

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【答案】应助回帖

一看都是引物没设计好，怎么可能用那么低的温度

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19楼2014-12-02 16:50:56

曼舞流苏

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【答案】应助回帖

引用回帖:

9楼: Originally posted by dulei at 2014-11-25 20:05:40
PCR对于退火温度的依赖性特别小，只要不是过高的Tm值，上下范围差个10度都能P出了，所以梯度PCR对于目标条带影响不大（会有“亮暗”的小区别，不会引起目标条带“有无”的区别）。

你这种情况，模板可能加的过多 ...

为何我做梯度时候产物溶解曲线的峰就不一样呐，不合适的温度的溶解曲线峰是多峰，而合适温度峰是单峰。。

20楼2015-01-07 16:17:27