24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 2845  |  回复: 25

aotoulan

禁虫 (小有名气)


感谢参与,应助指数 +1
luchao507(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-26 10:16:22
本帖内容被屏蔽

11楼2014-11-25 20:46:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

aotoulan

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

12楼2014-11-25 20:57:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

AQ-Bio-Z

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
luchao507(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-26 10:16:31
感觉是模板不行了,你扩下内参看看先

[ 发自小木虫客户端 ]
13楼2014-11-25 20:59:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hihe99

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
从你说的来看,引物的gc含量可能比较低是吧,然后做梯度pcr到42能有带,说明体系是应该没问题的,如果gc含量是比较低的话,可以试试把变性到退火,退火到延伸的升降温速度调低,调到用梯度时花的时间就差不多了,另外,如果引物够长的话退火温度可以不用那么低
14楼2014-11-26 13:45:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)

感谢参与,应助指数 +1
本帖仅楼主可见
15楼2014-11-26 13:55:47
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

蓝索道人

木虫 (正式写手)

还不是模板浓度太高了?你重复PCR时,模板是怎么加的啊,稀释个50,或者100倍试试
努力就有收获!
16楼2014-11-27 14:45:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

oO晶锅Oo

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

如你所说Tm值42℃,只出了一次条带,说明你的引物序列太短,我怀疑它的特异性。分析原因有二:你如果用的是Taq酶扩增没出条带就是酶或者cDNA或者引物水解坏掉了;你如果用的是Pfu酶扩增,很有可能是产物不特异,被酶水解掉了,又或者你先加了引物后加的cDNA导致引物被提前水解。建议:首先去NCBI-Primer BLAST网页确认你的引物与产物的特异性,那里还可以显示引物的Tm值,然后确认cDNA模板、酶保存完好没有水解坏掉。在此前提下,做个梯度PCR来确认退火温度,如果你不能做梯度PCR就用网站给出的Tm值减5-10℃作为退火温度。
17楼2014-11-28 15:47:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

静水流燊

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我觉得可能是模板的问题,我也遇到过,你的RNA是所有组织混合的么,可能没有表达,可以重新反转录一下试试
18楼2014-12-02 16:42:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

一看都是引物没设计好,怎么可能用那么低的温度

[ 发自小木虫客户端 ]
19楼2014-12-02 16:50:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

曼舞流苏

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by dulei at 2014-11-25 20:05:40
PCR对于退火温度的依赖性特别小,只要不是过高的Tm值,上下范围差个10度都能P出了,所以梯度PCR对于目标条带影响不大(会有“亮暗”的小区别,不会引起目标条带“有无”的区别)。

你这种情况,模板可能加的过多 ...

为何我做梯度时候产物溶解曲线的峰就不一样呐,不合适的温度的溶解曲线峰是多峰,而合适温度峰是单峰。。
20楼2015-01-07 16:17:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 luchao507 的主题更新
信息提示
请填处理意见