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1楼 2014-11-24 20:59:14

已阅关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

oO晶锅Oo

银虫 (初入文坛)

应助: 7 (幼儿园)
金币: 330.8
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在线: 17.9小时
虫号: 3564819
注册: 2014-11-28
专业: 遗传学研究新技术与方法

【答案】应助回帖

如你所说Tm值42℃，只出了一次条带，说明你的引物序列太短，我怀疑它的特异性。分析原因有二：你如果用的是Taq酶扩增没出条带就是酶或者cDNA或者引物水解坏掉了；你如果用的是Pfu酶扩增，很有可能是产物不特异，被酶水解掉了，又或者你先加了引物后加的cDNA导致引物被提前水解。建议：首先去NCBI-Primer BLAST网页确认你的引物与产物的特异性，那里还可以显示引物的Tm值，然后确认cDNA模板、酶保存完好没有水解坏掉。在此前提下，做个梯度PCR来确认退火温度，如果你不能做梯度PCR就用网站给出的Tm值减5-10℃作为退火温度。