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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR条件不可重复
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luchao507

禁虫 (小有名气)
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1楼2014-11-24 20:59:14
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oO晶锅Oo

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

如你所说Tm值42℃，只出了一次条带，说明你的引物序列太短，我怀疑它的特异性。分析原因有二：你如果用的是Taq酶扩增没出条带就是酶或者cDNA或者引物水解坏掉了；你如果用的是Pfu酶扩增，很有可能是产物不特异，被酶水解掉了，又或者你先加了引物后加的cDNA导致引物被提前水解。建议：首先去NCBI-Primer BLAST网页确认你的引物与产物的特异性，那里还可以显示引物的Tm值，然后确认cDNA模板、酶保存完好没有水解坏掉。在此前提下，做个梯度PCR来确认退火温度，如果你不能做梯度PCR就用网站给出的Tm值减5-10℃作为退火温度。
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17楼2014-11-28 15:47:02
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航帆

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
luchao507: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-11-24 21:20:38
有时候实验是个人品积累的过程……等人品攒够了，或许就出来了

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-11-24 21:19:13
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fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
luchao507(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-25 13:13:24
换酶试一下，我有一次摸索温度用rTaq酶出了目的条带，在重复就出不来了，换Etaq也没出来，换LA就出了
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3楼2014-11-25 07:55:43
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ixiaoye2012

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
luchao507(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-25 13:13:35
Tm42，这种结果也能信？给你个建议做一下降落PCR
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就算大雨将整座城市颠倒，我也会给你拥抱
4楼2014-11-25 11:37:09
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