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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » TA克隆 7.7Kb大片段
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wendy73

禁虫 (初入文坛)
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21楼2014-11-21 08:53:13
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
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20楼: Originally posted by wendy73 at 2014-11-21 08:51:35
刚做了一个5Kb的，连接效率还是不错的，首先是用的LA酶还是PFU酶，确定是否末端加A，然后加长连接时间，我是连了5个小时，最后转化效率还是比较好的。如果能整段克隆就尽量不要分段去做，先试试吧

你好，请问你用的T载体是何种T载体？pMD-19 simple T载体吗？我现在用全式金的Trans-T试过，效果不是太好。还有，你的模板的浓度时多大？与载体是何种比例加的，谢谢！
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22楼2014-11-24 19:25:41
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意萧02

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 百褶裙de夏天 at 2014-11-18 09:07:07
用T载体克隆的话，2～3kb效率比较高，超过5kb难度就比较大了，效率很低。ClonExpress Entry One Step Cloning Kit这个盒子你可以试一下，里面有个CE Entry vector，你可以把片段克隆到这个载体上面去，这个载体可以 ...

ClonExpress Entry One Step Cloning Kit可以用做过表达吗？我扩不出CDS，只能扩出DNA，有5K这样大小，能用这个载体吗？
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23楼2014-11-24 20:55:00
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by 意萧02 at 2014-11-24 20:55:00
ClonExpress Entry One Step Cloning Kit可以用做过表达吗？我扩不出CDS，只能扩出DNA，有5K这样大小，能用这个载体吗？...

这个是做克隆的试剂盒，不能做表达，5kb的应该好做
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24楼2014-11-24 22:50:50
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小木sigh

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 意萧02 at 2014-11-19 16:16:18
能问问怎么个温柔法吗？
...

他们的克隆用的是同源重组的，跟我以前用的不太一样，打电话问他们技术~蛮好的，慢慢跟我说，可以算手把手教我做实验了
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25楼2014-11-25 10:11:50
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wendy73

禁虫 (初入文坛)
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26楼2014-11-25 11:02:39
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by wendy73 at 2014-11-25 11:02:39
用的PUC-T simple，PMD-19以前也用过，效果一样的。目的片段胶回后浓度40ng/ul，连接加了1ul载体，2.5ul片段。连接时比平时时间长了很多。...

谢谢解答，最近刚做出来，终于连上了!
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27楼2014-11-25 23:48:07
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wendy73

禁虫 (初入文坛)
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28楼2014-11-26 09:14:59
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