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笨笨和傻猪

银虫 (小有名气)

应助: 3 (幼儿园)
金币: 1083.5
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在线: 54.8小时
虫号: 1362225
注册: 2011-08-06
性别: GG
专业: 微生物生理与生物化学

[求助] 为什么电转后筛菌，然后用通用引物PCR，但是空GS115都PCR不出条带？跪求！回复！！已有5人参与

我是电转整合型载体PpiczaA到毕赤酵母GS115中的，但是电转化完成后，进行筛菌。然后想通过菌落PCR先筛选一部分，以下是我的PCR方法及条件：
      1）我采用的用未做电转的空菌GS115做对照，挑取平板上的菌用宝生物的lysis buffer（code ：9760）裂解的，然后取1ul进行的PCR,用的是宝生物的Taq酶，50ul体系
      2)体系为：taq（5u/ml）： 0.25ul                      PCR条件：94℃          10min
                     10×PCR buffer： 5ul                                        94℃          30s
                     dNTPs（各2.5mM）：4ul                                     54℃          30s
                     模板为：             1ul                                     72℃          3min40s
                     3AOX（10uM）： 1ul                                        72℃             7min
                     5AOX(10UM）：    1ul                                     30个循环
                     灭菌水：             47.5ul
         跪求各位原因啊，哎，什么条带也不出，我尝试了好几次裂解方式，仍旧如此

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1楼 2014-11-13 17:58:21

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笨笨和傻猪

银虫 (小有名气)

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引用回帖:

11楼: Originally posted by alive_fs at 2014-11-26 10:02:47
你用的引物是基因引物还是载体引物啊，有可能是pcr条件的问题，还有就是pcr验证的时候最好设定两个对照一个阴性一个阳性，这样子就没多大的问题了，我做GS115电转后的pcr条件一般是一单元，1个cyc95℃4min，二单元3 ...

亲，好的谢谢您

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