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血清替代品：XerumFreeTM XF205 培养基添加物使用说明书 已有1人参与
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以下翻译仅供参考！最终使用者请参看英文原文说明书。 使细胞能在无血清环境中生长 确保无动物成分且经过GMP认证的细胞培养添加物 细胞的无血清培养具有一定的挑战性。这篇文章的目的是指导终端使用者平稳过渡到无血清环境中，且避免所有不足的或不恰当的努力。 理想的过渡到无血清环境下应该经历几个阶段，逐渐地筛选使细胞生长在无血清环境下。然而，如果所有关键步骤都能很好的解决，直接过渡到无血清环境下也有可能会成功。 无论使用什么方法，关键点包括细胞接种的生长状态，细胞接种密度，继代培养技术和细胞培养体系的生物物理属性。 TNCbio’s XerumFreeTM血清替代品已经作为一种培养基添加物使用，使用方法跟传统的细胞培养血清一样。然而浓度是5倍浓缩液，因此你可以添加2%浓缩液到常规培养基中，操作步骤跟平常一样。 内容 使用前重点注意事项 1 制备 1.1 常规的细胞培养基的制备 1.2 过渡到无血清环境下的常规调整方法 1.2.1 直接过渡 1.2.2 后续调整 2 XF205的使用 2.1 细胞系 2.1.1 贴壁依赖型细胞系 2.1.2 贴壁非依赖型细胞系 2.2 干细胞 2.2.1 准备步骤—包被 2.2.2 hESCs和hiPSCs的培养 2.2.3 MSCs的培养 2.3 原代细胞培养 2.3.1 普通建议 2.3.2 细胞培养的具体建议 2.3.3 推荐的体系 使用浓缩的XerumFreeTM XF205之前的重点注意事项： --XF205是一种替代血清的细胞培养基附加物，并不是最终的培养基。 --XF205必须和基础细胞培养基一起使用（比如IMDM, DMEM-F12或其它基础培养基）。 --无需对XerumFreeTM XF205或加了XerumFreeTM后的培养基过滤处理。 --如果需要，先滤灭培养基，然后在无菌条件下添加XerumFreeTM XF205到滤灭的培养基中。 --相比于血清， XF205是5倍浓缩液，因此使用同等的量的话（比如2% XF205替代10% FBS）。 --XF205不含有生长因子如细胞因子，激素等，因此也不含有胰岛素。 1 制备 1.1 无血清细胞培养基的普通制备方法 使用之前轻轻地、短暂地摇晃XerumFreeTM瓶。 添加5倍浓缩的XerumFreeTM到你的基础培养基中（如10% FBS相当于2% XF205）。 不要滤灭XerumFreeTM或不要滤灭添加完XerumFreeTM后的培养基（XF 205是无菌的）。 如果培养基需要滤灭，则需在添加XF之前滤灭。 在这个阶段不要添加抗生素，实际上，抗生素像其它许多化合物一样会结合到血清的浆蛋白上，尤其是结合到白蛋白片段上。因此在无血清和白蛋白条件下同样浓度的抗生素将显示出较高的生物活性，且这种增加的活性对细胞生长可能产生有害的影响。 以防无抗生素培养不可行，建议添加50mg/L的庆大霉素到培养基中。 *一些使用者喜欢或需要在无胰岛素条件下培养细胞，如果您使用XerumFreeTM培养细胞，您可以选择添加或不添加胰岛素或其它的生长因子来培养细胞。如果需要添加胰岛素促进细胞增殖或性能研究，我们建议添加终浓度为1.25mg/L重组胰岛素到细胞培养基中。 1.2 过渡到无血清环境中的常规方法 通常有两种方法使细胞过渡到无血清环境下生长。 1.2.1 直接过渡 直接把细胞从含有血清的培养基转换到无血清培养基中。 1.2.2 逐渐适应法 按照以下步骤逐步地把细胞从含有血清的培养基中过渡到无血清培养基中，每一步把含有血清的培养基减半，因此按照下面的比例值来添加无血清培养基： 阶段1：50% XerumFree-supplemented 培养基 / 50% Serum-supplemented 培养基 阶段2：75% XerumFree-supplemented 培养基 / 25% Serum-supplemented 培养基 阶段3：87.5% XerumFree-supplemented 培养基 / 12.5% Serum-supplemented 培养基 阶段4：93.75% XerumFree-supplemented 培养基 / 6.25% Serum-supplemented 培养基 阶段5：96.88% XerumFree-supplemented 培养基 / 3.12% Serum-supplemented 培养基 阶段6：98.44% XerumFree-supplemented 培养基 / 1.56% Serum-supplemented 培养基 阶段7：100% XerumFree-supplemented 培养基 按照以上步骤如果细胞生长不好，则返回一步，细胞生长恢复正常再继续下面的阶段。 细胞培养物可能由不同的细胞系构成（贴壁细胞或悬浮细胞）或原代细胞培养物。然而，从功能角度来看，干细胞制备过程中细胞类型可能分化为不同的程度或显示出未分化特性。在不同情况下，为了保证我们培养的细胞获得最大的成功，我们要考虑到不同的细胞类型有不同的要求，需要不同的过渡方法。 基于此原因我们把过渡程序分为三部分，对应于三种细胞分别为： 2.1 –细胞系 2.2 –干细胞 2.3 –原代细胞 2.1 细胞系 以下操作流程对于常规（二倍体细胞，有限细胞系）或转化的或永生细胞系（无限细胞系）是有效的。 2.1.1 贴壁依赖性细胞系 关键成功因素： --理想的细胞贴壁包被物 --最小化胰蛋白酶作用 --抗生素体系的选择 实验步骤 A） 用足够的细胞贴壁因子包被细胞培养容器表面。 --一些商用的包被试剂如PronectinTM F, MapTRIXTM或同等的其它产品 --纤连蛋白或多聚赖氨酸或其它 --少量FBS(如对于T25烧瓶添加500ul) 37℃孵育过夜，随后用新鲜培养基或PBS洗两遍。 --利于细胞贴壁的一种即用型塑料器皿。 B）解离细胞成单层细胞 --在无血清条件下使用标准胰蛋白酶可能不太可行，因为血清中含有胰蛋白酶抑制剂。因此为了避免对细胞产生不可逆的损伤，在无血清条件下，最小化残留胰蛋白酶水解活性是非常重要的。为达到最佳效果，可使用胰蛋白酶抑制剂（比如来源于大豆）或用无哺乳动物源的分散剂如Accutase™，且Accutase™在传代过程无需进行失活处理或去除。另外也可以通过洗细胞的方法来去除大部分残留的胰蛋白酶。然而这个方法需要额外的离心步骤，而离心对于某些细胞类型可能有损伤。 --优先选择：不使用胰蛋白酶，使用Accutase™ 或 Detachin™分散细胞为单层细胞；这些细胞分散液已经能够满足温和，有效的分散贴壁细胞的要求；将不会损伤细胞膜和表面表位并且能够保持蛋白表面的结构和功能性能完整。 C）细胞以20000/cm2的密度接种到按照Point 1所制备的完全培养基中。 在从血清培养基到无血清培养基适应过程的第一步中观察高接种密度的状态是重要的。细胞一般可分泌大量调控细胞贴壁、生长和增殖的因子到培养基中。然而，在刚接种时新鲜的无血清培养基中是不含这些因子的，因此为了及时诱导产生足够的自分泌/旁分泌因子，接种时达到细胞密度的临界值是至关重要的。 D）孵育并维持细胞在37℃中培养直至达到80-90%的汇合。 在这个阶段每2-3天换75%培养基。不要丢弃用过的培养基，而把它们收集起来，滤灭并保存于4℃为下一步使用。如果细胞在任何点看起来是停止状态的，那么给更多的时间让细胞去适应新的无血清环境。 E）当接近汇合率时，以1：2或1：3的比例分开细胞。 对于XerumFreeTM的第二个阶段，包被是不需要的，强烈建议使用上一步用过的培养基，因为里面含有调控细胞贴壁，蔓延，生长和增殖的自分泌因子。在含有75%的新鲜无血清培养基+25%用过的培养基（上一步收集起来的）接种细胞。继续每2-3天用75%新鲜培养基更换，以供给细胞，且按照d）步骤继续收集用过的培养基。 F) 重复E）步骤，与之前在含有血清的培养基中的生长情况相比，直到细胞显示出类似生长动态。这个时候可以认为细胞系完全适应了无血清条件培养，这可能需要4-6个阶段。 G) 从这个阶段开始，培养基中可能需要加抗生素。我们建议用广谱性抗生素庆大霉素；与标准的青霉素/链霉素溶液相比，庆大霉素有较低的毒性，庆大霉素建议的使用浓度是：50mg/L。 H）一旦细胞适应无血清培养，就应使用原始的分配比例（在含有血清的培养条件下）。 2.1 细胞系 2.1.2 贴壁非依赖性细胞系 以下操作流程适用于生长在悬浮液中的细胞系。对于贴壁细胞过渡到无血清环境中悬浮生长，请参照TNC BIO’s 技术说明“细胞从单层到无血清环境悬浮培养的适应过程”。 关键成功因素： 抗生素体系的选择 实验步骤 A） 当细胞密度达到3-5×106细胞/ml（依赖于细胞系），开始转换到XerumFreeTM添加的培养基中。收集细胞悬浮液，取出少量进行细胞计数并对整个悬浮液以200g的离心力离心5分钟。 B） 完成细胞计数 C） 在添加XerumFreeTM的培养基中细胞密度为106细胞/ml时，重悬细胞颗粒。 在过渡过程的第一个步骤观察高的细胞接种密度是非常重要的。然而，在接种步骤中，新鲜的无血清培养基中是不含这些因子的，因此为了及时诱导产生足够的自分泌/旁分泌因子，接种时达到细胞密度的临界值是至关重要的。 D） 在37℃中孵育细胞培养物直到细胞密度达到大约3-5×106细胞/ml。 E）通过添加适当体积的新鲜培养基，以1：3或1：4的比例分开悬浮培养物（比如25ml细胞悬浮液+75ml 含有XerumFreeTM的培养基，分到四个单独的培养瓶中） F）重复E）步骤直到培养物显示出像在原来含有血清的培养基中的生长动态。从那时起，细胞系已经完全适应并可按照含有血清的培养基中的原始比例。 G）从这个阶段开始，培养基中开始加入抗生素。 我们建议使用浓度为50mg/L庆大霉素，与标准的青霉素/链霉素溶液相比，庆大霉素有较低的毒性。 2.2 干细胞 2.2.1 准备步骤—培养器皿表面的包被 如果培养的是人多能干细胞（hPSCs）或多潜能间充质/基质细胞，那么用足够的包被剂处理培养器皿表面是至关重要的，我们一般使用的是制备较粗糙的胞外基质，比如MatrigelTM。 然而，这些包被剂里含有一些不明确的成分比如小鼠肿瘤源的物质和动物源的成分存在等。 如果需要使用包被剂，我们推荐使用StemAdhreTM，因其是一个明确的基质，只含有一个由纯粹的人的序列组成的重组蛋白，因此可视为无动物成分（ACF），然而，并不是所有的组织培养板都能用StemAdhreTM Defined Matrix来包被。 第三种来自Corning 的feeder free，xeno free且化学成分明确的包被剂 SynthemaxTM Surface，这个产品为模仿细胞的天然环境而设计，经过特殊处理、即用型包被塑料器皿，经验证一些hESC和hiPSC细胞系已取得很好的结果。在初始的过渡期转换到SynthemaxTM可能需要注意，但几个阶段后细胞又会恢复良好的生长状态。 在血清替代品的使用说明中不包括MatrigelTM和StemAdhreTM的包被操作步骤。 关于SynthemaxTM包被塑料器皿的的详细信息请登录： http://www.corning.com/lifescien ... ture/synthemax.aspx 重点注意事项： --XerumFreeTM不含任何的生长因子，因此也不含有bFGF和胰岛素。培养干细胞时我们建议添加bFGF或胰岛素或IGF。 --XerumFreeTM不含硒，培养干细胞时我们建议用含有硒的培养基。 2.2.2 hESCs 和hiPSCs的无饲养层培养 按照上面的包被步骤在含有2-3%的XerumFreeTM的DEME/F-12培养基里培养多能干细胞。 外部的和自分泌的信号的作用是基质重塑和维持胚胎干细胞的更新（Przybyla, L.M. and Voldman J. PNAS vol. 109 no. 3, 835-840, 2012）。基于此，为了不耗尽这些重要因子，按照下面的描述改变操作步骤使其粘附在培养基中极其重要。 hESCs和hiPSCs完全培养基的制备 --使用常规基础培养基（比如DMEM-F12） --添加浓度为2 mM的L-谷氨酰胺到培养基中（比如吸取200 mM的母液1.0ml到终体积为100ml的培养基中） --添加bFGF使终浓度为4 ng/ml（比如母液为10 ug/ml吸取40ul到终体积为100ml的培养基中） --添加2-巯基乙醇使终浓度为0.1mM（比如母液为55mM吸取182ul到100ml培养基中） --如果使用抗生素保护体系，我们建议使用浓度为50mg/ml的庆大霉素。 --因为XerumFreeTM不含胰岛素，你可以添加（重组）胰岛素或IGF到培养基中 --如果必要可以滤灭培养基 --添加2% 的XerumFreeTM XF205 含有XerumFreeTM的培养基中培养hESCs—第一阶段 --用MatrigelTM或StemAdhreTM包被6孔培养板或用SynthemaxTM培养器皿。 --融化一瓶新鲜的hESC或从现有的培养基中转移hESC细胞（从饲养层或无饲养层培养体系），用胶原酶或其它更好的方法处理，像平常一样使用Accutas和sediment，Accutas是非动物源的且具有蛋白酶和胶原酶活性，在hESC细胞的培养中已显示出显著的效果。 --用MatrigelTM或StemAdhreTM包被培养板：吸取过量的Matrigel或StemAdhre包被试剂 --SynthemaxTM培养板：无需处理，即可使用 --置细胞于按照以上步骤制备的完全培养基中 --通过连续7天每天更换75%的培养基培养细胞，余留25%的含有细胞的自分泌因子的培养基是非常重要的。 注意：与MEFs相比，细胞在MatrigelTM包被的板子上生长的更好且密度更高，且不失其形态学特征 细胞培养的传代 --用DPBS洗细胞一次 --添加分散酶（比如在DMEM-F12培养基中每孔添加1ml浓度为2mg/ml的酶溶液）并在37℃中孵育 --通过轻轻地拍打培养板的一侧在10-15 min内分散细胞 注意：勿刮细胞 --把含有细胞的分散后的溶液转移到一个灭菌的15ml管中，为了收集尽可能多的细胞，再用每孔1ml的生长培养基冲洗培养孔。 --离心并洗两次 --用吸头轻轻地吹打细胞，这样可使细胞在分散酶中轻易地分散开。 注意：体积较小的细胞和单个细胞不能很好地存活。 --以正常的比例包被培养板（Matrigel, StemAdhere, Synthemax-请参看上面的说明） 2.2.3 MSCs的培养 下面操作规程是在明确地环境中培养MSCs，可以是从液氮中保存的冰冻的细胞系或在不同的细胞培养体系中生长的培养物。 一般考虑 --如果MSCs细胞没有及时接种应保存在液氮中，过高的温度（-80℃）将对细胞造成不可逆的损伤。 --使用无菌操作技术且在超净工作台里操作 --37℃，5% CO2孵育箱内湿润孵育细胞 --培养器皿必须按照在使用说明B部分的准备步骤关于“培养表面的包被”的说明来处理 --细胞接种密度以2000 /cm2，避免生长的细胞融合，当细胞密度达到大约70%时继代一次 --使用无需经血清失活的消化酶，比如AccutaseTM --收集之后，轻轻地吸吐细胞使其重悬，不要旋涡细胞 --按照下面的描述准备细胞培养过程中所用到的所有材料和设备 --预热所有与细胞接触的溶液和培养基 完全培养基的制备 --你可以用你常规使用的基础培养基 --添加浓度为2 mM的L-谷氨酰胺到培养基中（比如吸取200 mM的母液1.0ml到终体积为100ml的培养基中） --添加bFGF使终浓度为4 ng/ml（比如母液为10 pg/ml吸取40pl到终体积为100ml的培养基中） --如果使用抗生素保护体系，我们建议使用浓度为50mg/L的庆大霉素。 --因为XerumFreeTM不含胰岛素，你可以添加（重组）胰岛素或IGF到培养基中 --如果必要可以滤灭培养基 --添加2% 的XerumFreeTM XF205 解冻细胞 在解冻过程中，必须要小心地轻轻地处理细胞，且立即放入预热的完全培养基中。 --在15ml的锥形离心管里放入10ml预热的完全培养基 --把细胞从液氮中转移出来 --把盛有细胞的锥形瓶放入37℃水浴中并轻轻地搅拌直至所有的冰融化。 --立即用70%乙醇消毒锥形瓶 --立即把细胞转入含有预热培养基的锥形瓶以300×g离心5min --吸取上清液并小心地在完全培养基中重悬细胞 --以2000-4000个细胞/cm2的细胞密度接种在由MatrigelTM或StemAdhereTM包被的细胞培养皿中，或即用型SynthemaxTM培养皿（Greiner） --在37℃，5% CO2的湿润孵育器中孵育细胞 --每天通过更换75%培养基来培养细胞，余留25%含有细胞自分泌因子的培养基是非常重要的。 当达到大约70%的融合时继代细胞培养 细胞的继代 --吸取细胞培养基，用DPBS(无Ca++/Mg++)洗细胞一次。 --用足够体积的AccutaseTM溶液浸没细胞层并在37℃孵育5min。如必要可通过轻轻地拍打细胞培养器皿的侧面分散细胞。 --加入完全培养基稀释细胞消化溶液（至少加两倍体积的AccutaseTM） --转移细胞悬浮液到离心管中，然后以300×g离心5min --弃上清然后在完全培养基中通过轻轻地吸吐重悬细胞 --细胞计数 --以2000个细胞/cm2的密度接种细胞悬浮液到一个新的包被的培养板中或即用型SynthemaxTM培养皿中（参看上面“培养器皿表面的包被”） --在37℃，5% CO2的湿润孵育器中孵育细胞 --当细胞融合达到近70%时尽快地进行继代培养，一般情况下每周继代两次。 2.3 原代培养 原代细胞培养物存在于刚刚从活的组织或器官分离而来的生长的细胞。这些细胞代表着细胞培养世界的核心：到目前为止所有的细胞系都起始于原代培养。除了产生新的细胞系，原代培养代表着一个非常重要的工具，尤其在药物发现和生产，再生医学和基础研究领域里。 从技术角度来看，在细胞培养过程中原代细胞培养仍然是最微妙的一部分。新分离的细胞没有任何选择压力且高度保留着体内部分的特征。这就要满足新分离细胞对营养和生理的要求。在理想地情况下，对于原代细胞的培养应尽可能地模仿体内的环境，比如细胞外空间。只在明确的细胞培养条件下，且对营养和细胞因子的供给完全地控制才能够实现这一理想情况。 原代细胞培养有着非常不同的要求，取决于组织的来源。在无不明确的添加物比如牛血清或其衍生物的条件下，已经证明XerumFreeTM在不同的原代细胞培养中取得成功。然而，没有一个通用的能满足所有原代细胞类型培养的配方。 下面的指导方针分为两部分：应用于所有细胞类型的常规建议和主要组织类型的具体要求。 2.3.1 常规建议 无论所用的是哪种细胞类型，如果选择无血清条件下进行原代细胞培养，需按照以下几点进行处理。 无血清贴壁因子 准备步骤--培养器皿表面的包被 在明确的培养条件下，用足够的包被剂处理培养表面是至关重要的。通常细胞外基质（ECM）的制备较粗糙，比如小鼠肉瘤提取物（比如基质胶）或提取的胶原。然而，不明确的天然成分和动物源成分的存在显示许多应用是有问题的。 如果不想培养基中含有的动物源成分造成任何问题，快速的解决方法可以考虑用已采用少量FBS过夜处理的细胞培养板。这个方法是方便经济有效的，然而它将意味着从完全明确的培养环境的概念中后退一步。 今天可以用现成的重组的，明确的包被试剂盒，尽管是来源于纤连蛋白，层粘连蛋白，胶原蛋白，E-钙粘蛋白，玻连蛋白等生物合成的信号肽，但能模仿ECM蛋白的贴壁性质。 无血清酶抑制剂 消化酶 开始一个原代培养主要有两种方法：通过从组织块中分离或酶解离而来的产物。在后一种方法中起始组织用蛋白水解酶或酶溶液消化，比如分散酶，胶原酶和胰蛋白酶。 接种细胞之前必须小心地中和/失活任何有蛋白水解活性的成分。尤其是使用胰酶时必须解决这个问题。 无血清的环境中使用标准胰酶制备可能会出现问题，因为血清中含有胰蛋白酶抑制剂。分散细胞之后，在无血清条件下胰酶活性必须被失活，可以用一个高效的胰酶抑制剂，比如大豆胰酶抑制剂。 作为胰酶的替代品，强烈建议使用AccutaseTM，因为其不需要被失活。这个重组的非哺乳动物来源的酶已经高效地应用于一系列原代细胞培养中，包括原代平滑肌细胞，原代人内皮细胞，原代鸡神经细胞。 无血清蛋白的结合 抗生素的使用 像其它化合物一样抗生素结合到血清的血浆蛋白上，尤其是白蛋白片段。因此，在无血清和白蛋白的条件下同样的抗生素浓度将显示出较高的生物活性，且增加的活性将对细胞生长造成有害影响。尤其是链霉素会干扰哺乳动物细胞蛋白合成水平。 如果无抗生素培养是不可行的，我们建议使用浓度为50mg/L的庆大霉素。 2.3.2. 针对细胞类型的具体建议 根据组织来源不同，原代细胞培养有不同的细胞培养要求。 在这个册子里我们没有具体描述原代细胞培养操作流程，因为不同的细胞类型之间是截然不同的。一般情况下我们建议用传统的方法分离原代细胞，并且用5倍浓缩的XerumFreeTM代替血清。 这将满足大多数细胞类型的营养需求，事实上，在哺乳动物细胞培养这个领域，营养需求稍有不同，更多地依赖于细胞类型，比如肝细胞需要更高的营养浓度。 不同类型的细胞之间对生长因子和激素的需求是不同的。 下面的表格列出了我们推荐用XerumFreeTM代替动物血清的细胞培养基制备。 关于指定的四种细胞类型，生长因子和激素的添加对于细胞发育和增殖是理想的。有关XF205详情请联系启维益成。 2.3.3推荐的四种主要的原代细胞类型的细胞培养基的建立 原代细胞培养类型 推荐 终浓度 要求 生长因子 激素 原代肾细胞 XerumFreeTM XF205 2% 基础培养基： DMEM高葡萄糖/F-12 或 肾上皮细胞基础培养基比如ATCC®PCS-400-030 重组人胰岛素 0.5 ug/ml 必需的 皮质醇 0.1 ug/ml 必需的 肾上腺素 0.5 ug/ml 必需的 重组人EGF 50 ng/ml 理想的/有益的 三碘-L-甲腺原氨酸 10 pg/ml 必需的 重组人EGF 10 ng/ml 理想的/有益的 原代肝细胞 XerumFreeTM XF205 2-3% 基础培养基： Williams's Medium E 重组人胰岛素 5 ug/ml 必需的 皮质醇 0.5 ug/ml 必需的 重组人EGF 50 ng/ml 理想的/有益的 原代角质细胞 XerumFreeTM XF205 2% DMEM/F-12 1:3 ratio 牛垂体提取物（BPE） 4 ul/ml 必需的 皮质醇 5 ug/ml 必需的 肾上腺素 0.5 ug/ml 必需的 重组人EGF 0.125 ng/ml 理想的/有益的 原代心肌细胞 XerumFreeTM XF205 2% Claycomb Medium T3（三碘-L-甲腺原氨酸） 1ng/ml(1.5nM) 必需的 重组人胰岛素 5 ug/ml 必需的 重组人EGF 5 ng/ml 理想的/有益的 重组人bEGF 5 ng/ml 理想的/有益的 神经元细胞 XerumFreeTM XF205 2% DMEM高葡萄糖 重组人EGF 50 ng/ml 理想的/有益的 重组人胰岛素 0.5 ug/ml 必需的 *为了使细胞很好地贴壁和蔓延，我们强烈建议用CaCl2(0.06 mM) Nb. 不要滤灭XerumFreeTM。我们建议制备含有谷氨酰胺的基础培养基，如果生长因子和激素需要滤灭，可以滤灭之后再添加XerumFreeTM。 Nb. XerumFreeTM是5倍浓缩的，因此所加的5倍浓缩液比通常所用的FBS体积低（比如10% FBS相当于2% XerumFreeTM）。 Nb. 对于其它的原代培养细胞类型，可以联系TNC Bio，关于建议生长因子和激素的添加量，我们将尽可能地提供最大支持。 |
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