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[交流]
关于酶切！
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各位虫友，最近实验很不顺利，请大家帮帮忙！ PCR纯化产物和质粒分别用NdeI和HindIII进行分别但酶切过夜，然后16度连接过夜，连接时做了自连的对照，转化至感受态细胞。因为我没有使用T载体，所以酶切那步我没办法检测。Amp+平板上都长出了菌落，自连的对照相对少一点，有目的基因的平板多一点，这似乎合乎情理，可问题就是不管我用菌落做PCR还是抽质粒都没有结果？大家说这是什么原因阿？ |
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lixiaoyi1981(金币+3,VIP+0):个人的体会是最珍贵的，所以要鼓励一下
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1.酶切那步可以做一下单酶切验证的，上样孔排序为表达载体质粒，Nde I单酶切，HindIII单酶切，一般单酶切结果可以从图上看出来，因为超螺旋质粒比线性化的跑的靠前。但PCR产物做酶切一般就没法验证了。所以一般建议用T载体连接后在酶切，其实用试剂盒只要一周时间就能做好了，效率很高的。 2.关于连接，其实可以做一下连接PCR验证，原理和菌落一样，只不过用稀释连接液替代菌落，反应体系可以见pET表达系统手册。一般连接PCR验证没问题的话接下去做转化信心可以大增。另外有人建议在连接前增加加热步骤可以提高连接效率，这个可以参考以下链接： http://www.protocol-online.org/p ... ting-step-2601.html 3.转化的时候做自连对照是必要的，不过一般转化时候出现问题是比较少见的。以前我做的时候其实自连长得菌落也不少，还有就是LB/Amp平板上生长的话一般不要超过两天，不然会有卫星菌落出现，要挑大个的，而不是周围小个的那些。如果你觉得转化不放心，还可以增加一个空宿主菌的对照。 总体来说，酶切和连接出现问题的可能性最大，而且酶切回收的ＤＮＡ片段浓度一定足够，否则连接效率不高的话，很容易导致连接失败，或筛选不到正确的重组子。 个人的一些经验，呵呵 |
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