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向使用过clonetech的infusion试剂盒做载体构建的站友求助啊 已有1人参与
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本人想构建一个带有GFP的pbi121载体，进一步进行下一步的亚细胞定位实验（使用农杆菌转染洋葱表皮细胞）。因为时间紧迫所以就选择了，clonetech的infusion，但是涂板后却怎么也长不出菌落，空荡荡的一个菌都木有啊 ~~~基本信息如下： pbi121载体使用SmaI和SacI双酶切，然后琼脂糖凝胶电泳回收，最后水回溶，使用Nanodrop测定浓度为48ng/ul. insert片段sGFP凝胶电泳回收，用水回溶，测试浓度57ng/ul. 反应体系：insert 1 ul vector 7 ul 5X In-Fusion HD Enzyme Premix 2 ul 50 C反应15min，然后用取出2.5ul直接转化50ul的DH5a感受态，其余的反应液-20C保存。因为没有长出菌落，又将剩余的反应液用TE稀释10倍后，取2.5ul和5ul分别转化50ul DH5a，还是木有菌落长出。抗性平板使用的是50ug/ml Kan+抗性的LB平板，都是新配的。 设计的infusion引物如下： 设计上游引物：ctctagaggatcccc ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 设计下游引物：GATCGGGGAAATTCG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC 下划线部分为sGFP上的特异性引物。 使用的感受态细胞为DH5a，阳性pbi121载体对照也做了，阴性的双酶切后载体转化也做了，都正常。 真诚向各位大神求助~~~~ |
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