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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 向使用过clonetech的infusion试剂盒做载体构建的站友求助啊
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wanglecas

新虫 (小有名气)

[求助] 向使用过clonetech的infusion试剂盒做载体构建的站友求助啊 已有1人参与

本人想构建一个带有GFP的pbi121载体，进一步进行下一步的亚细胞定位实验（使用农杆菌转染洋葱表皮细胞）。因为时间紧迫所以就选择了，clonetech的infusion，但是涂板后却怎么也长不出菌落，空荡荡的一个菌都木有啊~~~
基本信息如下：
pbi121载体使用SmaI和SacI双酶切，然后琼脂糖凝胶电泳回收，最后水回溶，使用Nanodrop测定浓度为48ng/ul.
insert片段sGFP凝胶电泳回收，用水回溶，测试浓度57ng/ul.
反应体系：insert                                                       1 ul
                  vector                                                     7 ul
                 5X In-Fusion HD Enzyme Premix               2 ul
50 C反应15min，然后用取出2.5ul直接转化50ul的DH5a感受态，其余的反应液-20C保存。因为没有长出菌落，又将剩余的反应液用TE稀释10倍后，取2.5ul和5ul分别转化50ul DH5a，还是木有菌落长出。抗性平板使用的是50ug/ml Kan+抗性的LB平板，都是新配的。
设计的infusion引物如下：
设计上游引物：ctctagaggatcccc ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
设计下游引物：GATCGGGGAAATTCG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC
下划线部分为sGFP上的特异性引物。
使用的感受态细胞为DH5a，阳性pbi121载体对照也做了，阴性的双酶切后载体转化也做了，都正常。
真诚向各位大神求助~~~~
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幸运的小栗子

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1楼 2014-10-13 10:40:57
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jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanglecas: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-10-13 18:52:23
可能是你酶切的载体没收回来吧，121 太大了回收的效率低。
另外连接的体系片段的用量也不多。。加大
还有可能生长的时间不足，放长点时间试试。
赞一下(1人) 回复此楼
学习再学习，努力再努力。
2楼2014-10-13 15:59:47
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幸运的小栗子

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
请问你用infusion酶后来做出来了吗
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3楼2014-10-14 17:28:15
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wanglecas

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 幸运的小栗子 at 2014-10-14 17:28:15
请问你用infusion酶后来做出来了吗

还没有，暂时还没有找出问题在哪儿
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4楼2014-10-14 20:38:36
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渊渟岳峙

新虫 (初入文坛)
请问最后您是怎么解决In-fusion这个问题的呢？我也遇到了这个问题 找不到原因！
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5楼2016-03-01 10:08:04
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learner_zyj

新虫 (小有名气)
说明书上建议片段：载体摩尔比为2:1。楼主后来做出来没有？
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6楼2017-12-03 00:13:35
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真如苑403

新虫 (初入文坛)
楼主做出来了吗，我也是一样的方法，卡在这了

发自小木虫Android客户端
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7楼2018-09-01 15:36:02
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