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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切回收
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爱一生恋一世

银虫 (小有名气)

[求助] 酶切回收 已有3人参与

研一新生，这两天都在做酶切回收，酶切一个重组质粒和PKC1139 ，1139酶切后电泳条带比较亮，重组质粒切了很多次都不亮，加入的量从3ul 到8ul都不亮， 请问下这其中可能的原因是什么？然后回收pkc1139，完全按照步骤来的，可是回收不到，想请问各位大神，在回收的过程中应注意什么啊？
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任何事情只有靠自己
1楼 2014-10-03 15:11:01
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fMssop

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-10-03 20:18:44
第一，一般我做酶切回收的话，都是100ul做胶回收；
第二，如果质粒切不开，而目的片断能切开证明不是酶的问题，那就只能看看载体上是否具有这两个酶切位点了，楼主可以再查看一下。
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2楼2014-10-03 17:20:41
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by fMssop at 2014-10-03 17:20:41
第一，一般我做酶切回收的话，都是100ul做胶回收；
第二，如果质粒切不开，而目的片断能切开证明不是酶的问题，那就只能看看载体上是否具有这两个酶切位点了，楼主可以再查看一下。

你怎么能看出基因切开切不来，就两头加的酶切位点，1 ％的胶看不出来的

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天道酬勤
3楼2014-10-03 19:05:13
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-10-03 20:18:51
爱一生恋一世: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2014-10-05 14:36:19
先看看你的质粒是不是低拷贝的，可以先把刚提出来的质粒点1ul看看亮度，如果低拷贝，那就多摇点菌多提点质粒浓缩一下，这是质粒的问题。第二，你说酶切你只加最多8ul体系？！几个意思？只加8ul质粒？不会吧，我们一般都要根据质粒浓度加到2ug的。然后，你的酶注意一下在共用buffer里的酶切效率，和在质粒图谱上的距离等等，这些应该都是你在设计引物的时候就已经考虑进去了。最后，回收的话，现在应该都是用的试剂盒了，按照说明书的步骤，没有特别要注意的，随便一回收都能回收出来东西的，至于你说回收不出来东西，我猜多数是你质粒本身的原因（低拷贝），然后你酶切体系太小导致的

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天道酬勤
4楼2014-10-03 19:12:17
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zergbloody

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-10-05 00:45:46
只要能切开 肉眼可见 就可以做回收 这种浓度做后续的连接是没有问题的

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5楼2014-10-04 23:24:20
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