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Crescendo铁杆木虫 (著名写手)
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dsRNA合成策略的一些思考
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最近计划合成dsRNA， 方法一，用带T7序列的上下游引物扩增目标基因序列得到dsDNA，以此dsDNA为模板进而合成合成+(-)ssDNA，最后根据试剂盒说明以ssDNA合成dsRNA； 方法二，用不带T7上下游引物扩增目标基因序列得到dsDNA，连接到pGEM-T载体（此载体带T7序列和SP6序列），测序验证正确后，再以此携带目标基因序列的pGEM-T质粒为模板，以T7和SP6引物扩增目标序列得dsDNA，此时理论上该dsDNA带有T7和SP6序列以及一些酶切位点序列；以此dsDNA为模板用T7引物合成+ssDNA，最后根据试剂盒说明以ssDNA合成dsRNA。 第一种方法最为省事，但我目前没有带T7序列的引物，合成后再做，要花一些时间，现在手头上有带目标基因序列的pGEM-T质粒。 求教： 第二种方法可行吗？ 会不会因为增加了酶切位点的序列而影响后续RNA干扰效果？ |
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