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关于三条引物鉴定小鼠基因型的疑惑 已有2人参与
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| 说明书写着能P出两条带的是杂合，只p出较大的条带的是纯KO，只p出较小带的是WT，但是我的疑惑是，三条引物中有一个是共同下游引物，一个是WT的上游引物，一个是插入片段的上游引物，即使是纯KO，依然可以P出两条带啊（WT的上游引物依然可以作用吧），不解！难道是插入的片段太长，导致WT的上游引物与共同引物p不出来（中间夹杂着插入片段）。 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
lmc2537: 金币+8, ★★★很有帮助 2014-09-16 15:19:01
感谢参与，应助指数 +1
lmc2537: 金币+8, ★★★很有帮助 2014-09-16 15:19:01
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纯合缺陷的小鼠肯定就不存在WT的那条上游引物结合位点了。WT的那条上游引物的结合位点肯定是敲除的目的基因中的一段。 按你这种老鼠，较大片段的应该是下游共同引物（无论WT或者KO都存在）与KO小鼠引物（一般是插入的缺陷性载体中的一段）之间产生的片段；较小片段应该是WT上游引物（一般是靶基因的某个外显子上）与共同引物之间的一段。（另外我一般见到的多数是较大的是WT，较小是KO，因为KO掉靶基因肯定是比WT缺少了几个外显子的部分） 所以KO是不可能产生两条带的，因为WT上游引物（即靶分子中的一段）在KO中是不存在的（即敲除掉了）不能结合基因组的。 如若再不明白，可以仔细找两篇缺陷鼠构建的文章看看。 |
3楼2014-09-16 13:03:55
zero19871029
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2楼2014-09-16 11:04:37
4楼2014-09-16 15:19:28