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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 克隆问题
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95846713

新虫 (初入文坛)

[求助] 克隆问题 已有3人参与

本人新手  做克隆  目的片段1000左右 胶回收后很亮 连接pmd-18t 16度过夜连接 再转化到DH5a 蓝白斑筛选后 菌落PCR 菌液PCR电泳后什么都没有 ，做实验的同时帮别人做了2个700+的目的片段克隆，帮别人的片段连了4个小时然后转化DH5a后菌落菌液 pCR电泳后都很亮，然后人家拿回去送公司测序了， 自己的目的片段克隆做了7次了什么都没有，那位大神帮忙分析分析 我做别人的和我自己的克隆 都是一样的手法，只是目的片段大小不同  有没有可能引物设计的不好啊？ 但是PCR和胶回收产物都很亮啊，我真是不会了
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1楼 2014-09-11 20:07:04
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DoctorWatson

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你菌液是小提质粒吧。我以前连的是PGEM-T easy载体。提还是能提出来的。
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2楼2014-09-11 21:54:59
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95846713

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by DoctorWatson at 2014-09-11 21:54:59
你菌液是小提质粒吧。我以前连的是PGEM-T easy载体。提还是能提出来的。

小提有什么影响吗？ 回收产物很亮，就是连不上 ，也长菌，就是菌落PCR 没有，回收产物污染会影响亮度吗？
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3楼2014-09-11 22:22:25
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kehan777

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
95846713(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-12 10:40:46
95846713: 金币+2, ★有帮助 2014-09-15 09:41:35
菌液里还有培养基的成分，菌本身不是单纯的DNA，它不像质粒，所以PCR时对体系有影响正常；提质粒后做PCR或酶切鉴定也是一种方法。
如菌液PCR：
1. 预变性的时间延长，有些人先煮沸+离心，或者直接挑菌斑，而不是用菌液
2. PCR buffer稍微加多一点
3. 因P不出来，也可能退火温度高了些，可以稍微降低一点
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4楼2014-09-12 07:38:27
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95846713

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kehan777 at 2014-09-12 07:38:27
菌液里还有培养基的成分，菌本身不是单纯的DNA，它不像质粒，所以PCR时对体系有影响正常；提质粒后做PCR或酶切鉴定也是一种方法。
如菌液PCR：
1. 预变性的时间延长，有些人先煮沸+离心，或者直接挑菌斑，而不是用 ...

哦  是这样啊 非常感谢
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5楼2014-09-12 09:43:39
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
95846713(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-12 10:41:01
T载体连接效率非常高，楼主可以提质粒后酶切鉴定，或者PCR。另外楼主最好分析下蓝白斑，看看你的片断连接上去后是蓝斑还是白斑？？有可能连接后是蓝斑而不是白斑！祝好运！··！
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6楼2014-09-12 10:11:34
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95846713

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by huyan0817 at 2014-09-12 10:11:34
T载体连接效率非常高，楼主可以提质粒后酶切鉴定，或者PCR。另外楼主最好分析下蓝白斑，看看你的片断连接上去后是蓝斑还是白斑？？有可能连接后是蓝斑而不是白斑！祝好运！··！

好的谢谢
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7楼2014-09-12 14:44:45
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