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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)

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[求助] 激光共聚焦已有1人参与

本人打算做激光共聚焦，新手一枚。翻阅了一些文献学位论文，大致如下：
37℃细胞培养箱共孵育后弃去培养液。
PBS洗涤后用4%多聚甲醛37℃培养箱内固定15分钟；
弃去固定液并PBS漂洗3次后，用3%BSA封闭1小时；再次PBS洗涤后，用3%BSA配制的一抗4℃孵育过夜
。次日PBS漂洗3次后，加入Alexa Fluor 488荧光兔二抗室温避光孵育2小时。
再PBS洗3次后，避光DAPI染色3分钟。
最后用PBS避光漂洗3次，置于激光共聚焦显微镜（NIKON A1，100倍油镜）成像观察和采集图像
但还有些疑问：
1.本人想做A与B在细胞上是否结合，不需要DAPI染色，是否只要将DAPI和PBS3次省略即可，前面相同；
2.A在膜上表达，B是荧光标记的小分子，所以都不在细胞内，是否还需要固定等增加通透性的流程；
欢迎各位提出宝贵意见，不胜感激。

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1楼 2014-09-09 23:03:30

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妃歌sindy

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiaoyu0127(红舟流星代发): 金币+5, 代扣代发金币 2015-02-16 10:59:34

我之前做的是测定膜上两分子在某细胞因子刺激后是否发生相互作用。主要的方法如下:
1、首先将细胞接种于激光共聚焦小室中（conning的，有两孔、四孔、八孔等不同型号，看你实验条件选择），细胞接种尽量稀一点，最好能是细胞独立生长，拍出来的图像比较好看
2、待细胞成长至你所需密度时，开始免疫荧光实验。（最好在下午做，一抗4℃过夜孵育效果比较好）
3、如果不需要加刺激因子，则直接弃掉培养基，PBS稍洗三次，加入4%多聚甲醛or95%甲醇固定10min即可（固定液的选择主要看细胞，多聚甲醛固定后细胞会成圆形，而95%甲醇固定细胞能够维持细胞原有形状）
4、PBS洗涤三次，0.2%Triton X100打孔5min（膜上蛋白看结合位点，如果在膜表面则不需打孔）
5、PBS洗涤三次，加入5%BSA封闭37℃ 1h，封闭液使用量必须高于抗体使用量。
6、PBS洗涤三次，用1%BSA稀释抗体，4℃过夜孵育。（经验来讲，抗体浓度应稍高于说明书的使用浓度）
7、PBS洗三次，每次5min（必须清洗干净），以下步骤避光操作。
8、1%BSA稀释荧光二抗，并孵育细胞1h，PBS洗三次，每次10min
9、DAPI or hochest染核，PBS洗三次，每次5min（可省略）
10、激光共聚焦显微镜下成像。
希望能对你有帮助

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