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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 急急：连接问题！！！！！
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li5zi2jun1

[交流] 急急：连接问题！！！！！

我用BamHⅠ和XhoI双酶切Pet-32a和目的片段（1133bp），切胶回收后用T4连接酶连接，请问连接的时间和温度应该如何？XhoI需要平末端的连接条件吗？体系大概多少比较好？谢谢！！！
我转化效率都好低，长的几个菌用BamHⅠ和XhoI双酶切切出1500BP的带，酶活也测不出。
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1楼 2008-04-18 21:14:15
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bluesea1026

这两个酶的确是很普通的内切酶，不会太难做，保证质粒质量，按常规的酶切条件如37℃，4h~过夜都可以酶切完全。
载体要处理干净，尽量降低载体自连；保证感受态效率；
这些常规要求达到了，连接不成问题，按以上大家的条件都可以的。
至于酶活，好像不需要去测这个吧，按常规体系用量就可以了。
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4楼2008-04-19 13:17:10
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客
这两个酶都不是平末端的酶，你是怎么设计的引物？
连接条件大都是片断载体物质的量之比在3：1-9：1之间比较合适，16度连接过夜或者22度2小时或者4度24小时。
做实验不要埋着头猛做，多看看技术的原理，为什么这么去做，不要什么都不知道就去做，除了问题一点都不知道怎么回事。
转化效率低的原因很多，你这个讲得不要太笼统。
你的情况大家根本不清楚，你也没有具体描述，不能随便说到底问题出在哪里。
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For my life！
2楼2008-04-18 22:00:30
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十比

木虫 (著名写手)
我刚用这两个酶做过，放在16度，连3-4个小时足够了。
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3楼2008-04-19 09:11:03
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