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li5zi2jun1

[交流] 急急:连接问题!!!!!

我用BamHⅠ和XhoI双酶切Pet-32a和目的片段(1133bp),切胶回收后用T4连接酶连接,请问连接的时间和温度应该如何?XhoI需要平末端的连接条件吗?体系大概多少比较好?谢谢!!!
我转化效率都好低,长的几个菌用BamHⅠ和XhoI双酶切切出1500BP的带,酶活也测不出。
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客

这两个酶都不是平末端的酶,你是怎么设计的引物?
连接条件大都是片断载体物质的量之比在3:1-9:1之间比较合适,16度连接过夜或者22度2小时或者4度24小时。
做实验不要埋着头猛做,多看看技术的原理,为什么这么去做,不要什么都不知道就去做,除了问题一点都不知道怎么回事。
转化效率低的原因很多,你这个讲得不要太笼统。
你的情况大家根本不清楚,你也没有具体描述,不能随便说到底问题出在哪里。
For my life!
2楼2008-04-18 22:00:30
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十比

木虫 (著名写手)

我刚用这两个酶做过,放在16度,连3-4个小时足够了。
3楼2008-04-19 09:11:03
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bluesea1026

这两个酶的确是很普通的内切酶,不会太难做,保证质粒质量,按常规的酶切条件如37℃,4h~过夜都可以酶切完全。
载体要处理干净,尽量降低载体自连;保证感受态效率;
这些常规要求达到了,连接不成问题,按以上大家的条件都可以的。
至于酶活,好像不需要去测这个吧,按常规体系用量就可以了。
4楼2008-04-19 13:17:10
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