24小时热门版块排行榜

>论坛更新日志 (3793)
>虫友互识 (886)
>论文投稿 (268)
>休闲灌水 (229)
>导师招生 (169)
>基金申请 (149)
>文献求助 (147)
>硕博家园 (99)
>考博 (78)
>博后之家 (72)
>公派出国 (72)
>教师之家 (61)
>考研 (58)
>论文道贺祈福 (41)
>招聘信息布告栏 (39)
>找工作 (35)

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

fuchange918

木虫 (正式写手)

应助: 33 (小学生)
金币: 2368.4
红花: 4
帖子: 716
在线: 151.7小时
虫号: 1727732
注册: 2012-03-30
性别: GG
专业: 食用真菌学

[求助] Trizol 法怎么提取高质量RNA 已有5人参与

本人实验真菌用Trizol法提取RNA后，跑胶验证降解程度还可以忍受，但是污染方面很严重：OD260/280=1.5左右，OD260/230=1.0左右，后期需要做RACE
主要有一下问题：
（1）试验中哪些试剂需要预冷（4度还是-20℃），比如氯仿、异丙醇、75%乙醇
（2）每次异丙醇沉淀离心后，管壁上总是粘有和底部沉淀一样的东西，而且沉淀用DEPC处理水溶解时总是不能全部溶解，应该怎么解决？
（3）还有就这这么步骤中的放置时间，帮我看看有没有问题，是过长还是过短
本人RNA提取步骤：
1、细胞或组织加 Trizol 后，室温放置 5min，使其充分裂解。。
2、12,000rpm 离心 10min，弃沉淀。
3、按 200ul 氯仿/ml Trizol 加入氯仿，上下颠倒混匀后冰上放置5min。
4、4℃ 12,000g 离心 15min。
5、吸取上层水相，至另一离心管中
6、按 0.5ml 异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，冰浴放置10min。
7、4℃ 12,000g 离心 10min，弃上清，RNA 沉于管底。
8、按 1ml 75%乙醇/ml Trizol 加入 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
9、 4℃ 8,000g 离心 5min，尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥 5-10min。注：RNA 样品不要过于干燥，否则很难溶解。
11、可用 30ul DEPC处理水溶解RNA样品

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

1楼 2014-09-05 14:41:53

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

fuchange918

木虫 (正式写手)

应助: 33 (小学生)
金币: 2368.4
红花: 4
帖子: 716
在线: 151.7小时
虫号: 1727732
注册: 2012-03-30
性别: GG
专业: 食用真菌学

引用回帖:

15楼: Originally posted by a314919473 at 2014-09-09 08:45:03
用酚氯仿抽提固然很好，可是对你的RNA损失也比较大，所以直接用试剂盒就完全能满足你的需求，
生工的试剂盒不建议用来做RACE，这个毕竟要求也比较高，另外反转录试剂盒也要最好的。

RACE 买的clontech的Race试剂盒里自带反转录，现在就是纠结RNA提取不好