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求助指点HRP-TMB电化学体系的相关问题 已有1人参与
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我在做电化学检测，用的体系是HRP-TMB体系，先将HRP捕获在电极表面，然后在TMB-H2O2底物溶液中进行计时电流检测，实验过程中遇到很多问题，希望做过的前辈分析指点。 1.电化学中的TMB-H2O2的配方是否与比色检测中的配方一样？我使用的配方为TMB（1mg/mL,DMSO）:缓冲液（0.1M柠檬酸，0.2M磷酸氢二钠，pH4.9）：H2O2（30%）=100:900:1，但我看近些年发表的利用TMB-H2O2进行电化学检测的比较高档的文章基本都用的是Neogen公司的K-bule低活性底物溶液（含H2O2），不知道这跟自己配的有什么区别？ 2.实验中，我是将3uL 0.5U/mL的HRP滴加到电极上，捕获之后冲洗，然后将电极浸入到TMB-H2O2底物中进行检测。所以检测之前我先对HRP与该底物溶液之间的反应进行了评估，即将3uL 0.5U/mL的HRP直接加入到底物溶液中进行测量，但是产生的电流非常小（40nA）左右，这比文献中的检测背景电流还要低，而且我将HRP的量提高到两三倍时，电流值并没有升高，提高到100倍时，电流值才升高了几倍（但产生的颜色随着HRP的增强而变深，可以排除HRP活性的问题），请问这有可能是什么原因造成的？ 3.HRP加入到底物中后需要反应一段时间再进行电流测试还是立即测试？底物是一次性的还是可以重复进行多次电流测试？ 4.进行电化学检测之后底物溶液应该是蓝色还是无色？ 希望大家不吝赐教，非常感谢！！ |
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