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hongkaichen金虫 (小有名气)
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[交流]
求助，关于DNA提取问题。
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我想问下，我用CTAB法提取真菌DNA（菇类，还有一些其他的真菌）提出的带经常是好长的尾巴，但要的DNA好像没有。 我的CATB法是这样的，先用液氮研磨（菇类的不好研）有时也用烘干后研磨的粉末，然后加入预热的CTAB缓冲液（用粉末的时候还加入过蛋白酶K，用液氮研磨的时候也加过），65度水浴30分钟，有时也水浴过2个小时或更长时间，然后就是12000g离心5分钟，取上清加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），有时也直接用氯仿提，再12000g离心5分钟，取上清，重复上一步2-3次，直到没有蛋白质为止，然后加入2倍体积的乙醇和1/10体积的醋酸铵（由于没有醋酸铵加的是），静置10分钟，12000g离心10分钟，弃上清，用百分之70的乙醇清洗 ，再用TE溶解，再跑电泳，跑出来的带如图，有一次担到了但杂质特多，希望哪位好人能帮忙解释下！！谢谢！！ [ Last edited by hongkaichen on 2008-4-18 at 18:09 ] |
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看了你的提取步骤，给你以下建议： 1、收集样品（待提取DNA的菌）后，尽量将水分去除干净（最好用吸水纸反复吸2-3次） 2、在用液氮研磨的时候加入CTAB适量，研磨一定彻底、充分，可以边研磨边加入液氮 3、研磨后收集菌，将菌收集在1.5ML 的 EP 管中，加入约300uL的CTAB ，混匀后水浴 4、65度水浴1个小时，每隔20分钟轻轻混匀一次，一定要轻柔 5、第4步之后不要离心，加入等体积的苯酚：氯仿（总体积600uL） 需要注意的是：在研磨的时候CTAB的量不要超过300uL 6、混匀后离心，1，2000 rpm，30min 7、吸取上清，加入等体积苯酚：氯仿，混匀1，2000 rpm，20min 注意可以在抽提蛋白的步骤里加入RNase 8、之后就是先用无水乙醇洗两次，在用70%的乙醇洗两次，之后将管内的乙醇充分晾干了，加入DNA的溶解液就可以了（一般用Millipore的水就可以了） 9、检测时上样3uL即可 看了你的胶图，觉得你的问题可能主要在于：1、研磨不充分 2、在水浴时混匀的太剧烈 3、蛋白抽提彻底 真菌的DNA比较容易提取的，加油啊！ |
15楼2008-04-18 18:52:09
skkyy88888
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