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prominetsun

金虫 (正式写手)

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[求助] 关于Cre/loxP做酵母基因敲除的一些问题！求大牛们赐教啊啊啊！！已有1人参与

最近开始考虑做基因敲除，也不知道自己做一个基因敲除的周期是多少天，因为要敲个三五个基因。。。打算用 Cre/loxP 做基因敲除，找到的文献都是说设计的引物前 20 多个bp是目的基因上下游的同源臂，后面的十几bp与 pUG6 中 loxP-Marker-loxP 的上下游同源，这样势必会引入上游和下游的十几 bp 的碱基，我不明白为什么所设计的引物不是直接与 loxP 位点同源这样扩增出的敲除盒正好不包含其他碱基，有点想不明白为什么，第一次接触这样的领域，在实验室也是新手，所以有好多知识不懂，还请各位大牛们不吝赐教，如果能再详细的介绍一下 Cre/loxP 的敲除，怎么构建引物，需要做什么工作等切实可行的方案的话，我将不胜感激！

PS：下面是我抄的一张图，谁能告诉我绿色部分指的是什么？

IMG_20140830_155537.jpg

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1楼 2014-08-30 16:00:26

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ksws0465326

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

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prominetsun(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:26:51

楼主，你好，我最近也在用Cre，不过不是基因敲除，是酵母内目的蛋白荧光检测，其中要用到Cre移除标记性marker，也在学习中，你说的引物前20几个bp是目的基因上下游的同源臂，后面的十几bp与 pUG6 中 loxP-Marker-loxP 的上下游同源的这个问题，确切答案我也不是很清楚，至于那幅图的绿色部分，在丁香园论坛里几年前有过坛友分享。（http://www.dxy.cn/bbs/topic/16548414）
LoxP（locus of X-over P1）序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：
　　5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3'
　　3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'
相信，你那幅图中的绿色部分就是这13bp，其中红色剪头就是8bp序列的方向。
Cre介导的loxp过程可分为三种情况：
如你那幅图
1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；
　　2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；
　　3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。
另外，Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。利用这一特点，人们在构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列，以用于特定的基因突变或修复，增加了该系统的应用范围。（以上均为引用丁香园论坛帖子内容）
如果有需要的化我可以将介绍蛋白荧光鉴定的这篇protocol文章发给你供你参考