| 查看: 3333 | 回复: 2 | ||
prominetsun金虫 (正式写手)
|
[求助]
关于Cre/loxP做酵母基因敲除的一些问题！求大牛们赐教啊啊啊！！ 已有1人参与
|
|
最近开始考虑做基因敲除，也不知道自己做一个基因敲除的周期是多少天，因为要敲个三五个基因。。。打算用 Cre/loxP 做基因敲除，找到的文献都是说设计的引物前 20 多个bp是目的基因上下游的同源臂，后面的十几bp与 pUG6 中 loxP-Marker-loxP 的上下游同源，这样势必会引入上游和下游的十几 bp 的碱基，我不明白为什么所设计的引物不是直接与 loxP 位点同源这样扩增出的敲除盒正好不包含其他碱基，有点想不明白为什么，第一次接触这样的领域，在实验室也是新手，所以有好多知识不懂，还请各位大牛们不吝赐教，如果能再详细的介绍一下 Cre/loxP 的敲除，怎么构建引物，需要做什么工作等切实可行的方案的话，我将不胜感激！ PS：下面是我抄的一张图，谁能告诉我绿色部分指的是什么？  IMG_20140830_155537.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有252人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
ksws0465326
金虫 (小有名气)
- 应助: 49 (小学生)
- 金币: 885.4
- 红花: 6
- 帖子: 124
- 在线: 74.5小时
- 虫号: 3263751
- 注册: 2014-06-09
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
prominetsun(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:26:51
感谢参与，应助指数 +1
prominetsun(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:26:51
|
楼主，你好，我最近也在用Cre，不过不是基因敲除，是酵母内目的蛋白荧光检测，其中要用到Cre移除标记性marker，也在学习中，你说的引物前20几个bp是目的基因上下游的同源臂，后面的十几bp与 pUG6 中 loxP-Marker-loxP 的上下游同源的这个问题，确切答案我也不是很清楚，至于那幅图的绿色部分，在丁香园论坛里几年前有过坛友分享。（http://www.dxy.cn/bbs/topic/16548414） LoxP（locus of X-over P1）序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下： 5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5' 相信，你那幅图中的绿色部分就是这13bp，其中红色剪头就是8bp序列的方向。 Cre介导的loxp过程可分为三种情况： 如你那幅图 1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列； 2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位； 3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。 另外，Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。利用这一特点，人们在构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列，以用于特定的基因突变或修复，增加了该系统的应用范围。（以上均为引用丁香园论坛帖子内容） 如果有需要的化我可以将介绍蛋白荧光鉴定的这篇protocol文章发给你供你参考 |
2楼2014-09-01 15:57:04
3楼2014-10-15 21:55:17
100