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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建基因文库的方法筛选到阳性克隆，克隆中插入的基因长为8000bp，如何找到目的基因？
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木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小科研女dow: 金币+10, ★★★很有帮助, 好的，谢谢~~~ 2014-09-01 19:21:29
改用其他内切酶（比如识别4个碱基的）来切，进一步缩小范围；或改用外切酶切，不同酶切时间取样把内切酶失活，亚克隆，缩小范围。分析ORF除了ATG外，再考虑下其他GTG等作为起始密码子的可能ORF。
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为什么
11楼2014-09-01 00:29:02
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小科研女dow: 金币+4, ★★★很有帮助, 嗯的，我试着做做~ 2014-09-01 19:21:56
其实也可以这样策略，例如四个基因，就先表达含有其中三个基因的片段，看看有没有活性，如果有，就再少一个表达，如果没有，那么少掉的那个基因就是有很大嫌疑了

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12楼2014-09-01 06:53:29
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
找东西偶然找到了这个帖子，点开一看，发现时间已经过去挺久了，不知道楼主的事情解决了没有，我仅谈谈我的看法：
1、确实，常见的单体蛋白质的分子量如果有100KD就比较大了，就以这个分子量来计算吧。如果没有内含子，换算成DNA就是接近3KB，确实你这个8kb的片段里可能存在其它非目的基因的序列。
2、PUC19是表达型质粒，可以表达外源蛋白质。
3、不是启动表达的宿主菌，而是可以通过加诱导物来诱导质粒上的启动子，表达你克隆上去的目的基因。
4、经过软件划分ORF是不完全靠谱的，仅仅可以供参考，因为我曾经在一个来自丝状真菌的基因中找到8个ORF。你据此再克隆做了几个阅读框的表达，那就更加不应该了。
5、正确的方法是亚克隆，这也是我用过的方法。就是选择你的载体上没有但在你的8KB外源片段上有2个或以上的酶切位点，完全酶切，再让切出来的片段之间自连，连接产物中可能存在有活性的克隆，这样就去掉了部分非目的基因的序列。视情况，运气好的时候仅用一个内切酶就获得含很少多余序列的片段，运气差的时候你的目的基因里有很多个内切酶的位点，自连成为正确的序列的概率低，但也可以帮助你定位基因了。

另外，如果楼主已经用PUC19做表达了，请告诉我，我也有此想法，谢谢！
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
13楼2015-11-09 01:42:11
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小科研女dow

木虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2015-11-09 01:42:11
找东西偶然找到了这个帖子，点开一看，发现时间已经过去挺久了，不知道楼主的事情解决了没有，我仅谈谈我的看法：
1、确实，常见的单体蛋白质的分子量如果有100KD就比较大了，就以这个分子量来计算吧。如果没有内含 ...

谢谢你的回复，过了这么久还回复我。
关于这个问题，我们已经解决了，就是表达了其中所有的ORF,幸运的是其中一个很小的500bp左右的ORF是我们要找的活性序列。
祝好~~
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做出色的科研人
14楼2015-11-09 08:41:22
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
14楼: Originally posted by 小科研女dow at 2015-11-09 08:41:22
谢谢你的回复，过了这么久还回复我。
关于这个问题，我们已经解决了，就是表达了其中所有的ORF,幸运的是其中一个很小的500bp左右的ORF是我们要找的活性序列。
祝好~~...

请问你是用pUC19来表达的吗？
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15楼2015-11-09 20:30:51
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小科研女dow

木虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2015-11-09 20:30:51
请问你是用pUC19来表达的吗？...

筛选的时候是，后来ORF表达不是，选了表达性质粒，pet30a-(+)
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做出色的科研人
16楼2015-11-10 09:23:16
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
16楼: Originally posted by 小科研女dow at 2015-11-10 09:23:16
筛选的时候是，后来ORF表达不是，选了表达性质粒，pet30a-(+)...

你的基因是通过活性筛选得到的，能在大肠杆菌里表达的，所以可以用带强启动子的质粒来表达，我的是真菌的基因，用带有强启动子的质粒来表达形成了包涵体，没办法，只能试着用弱启动子的pUC19.
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17楼2015-11-10 20:02:11
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小科研女dow

木虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2015-11-10 20:02:11
你的基因是通过活性筛选得到的，能在大肠杆菌里表达的，所以可以用带强启动子的质粒来表达，我的是真菌的基因，用带有强启动子的质粒来表达形成了包涵体，没办法，只能试着用弱启动子的pUC19....

如果你的是真菌，那估计原核表达系统比较悬，为什么不用酵母等真核表达系统呢；其次，PUC19虽然有微弱的表达能力，但是毕竟不是首选的表达质粒，表达量太低，而且一般的PUC19用于表达的话都会事先进行改造。
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做出色的科研人
18楼2015-11-11 08:44:50
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