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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建基因文库的方法筛选到阳性克隆，克隆中插入的基因长为8000bp，如何找到目的基因？
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小科研女dow

木虫 (小有名气)

[求助] 构建基因文库的方法筛选到阳性克隆，克隆中插入的基因长为8000bp，如何找到目的基因？ 已有3人参与

各位虫子们，大家好，小虫今天提出一个长久困扰的问题，希望得到大家的建议，先谢过了~
最近做基因文库，采用的PUC19作为载体，将不完全酶切的片段插入该载体中后，转化大肠杆菌DH5α，经过筛选得到阳性克隆，将阳性克隆单菌落培养提取质粒后送去测序公司测序，得到一个片段为8000bp的结果，以下为后续工作中遇到的问题：
1、目的基因应该不至于是8000bp这么大，小虫认为实际的目的片段式这8000bp中的一部分，经过软件划分ORF做了几个阅读框的表达，但是均无活性。
2、PUC19不是表达型质粒，所以没有办法将筛选的重组质粒直接转化到Rosetta和BL-21中大量表达，得不到目的蛋白。
3、曾经见过有人对PUC19做过改造，可以用于表达蛋白，而不是仅仅用来克隆，但是自己经验欠缺，没有这方面的基础。
4、还有人说，可以采用可以启动表达的宿主菌，也只是听说，并未接触过。

楼主主要的目的是在这8000bp中寻觅到真正的目的片段，请问有什么好的意见吗？先谢过了!
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做出色的科研人
1楼 2014-08-28 17:05:27
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
找东西偶然找到了这个帖子，点开一看，发现时间已经过去挺久了，不知道楼主的事情解决了没有，我仅谈谈我的看法：
1、确实，常见的单体蛋白质的分子量如果有100KD就比较大了，就以这个分子量来计算吧。如果没有内含子，换算成DNA就是接近3KB，确实你这个8kb的片段里可能存在其它非目的基因的序列。
2、PUC19是表达型质粒，可以表达外源蛋白质。
3、不是启动表达的宿主菌，而是可以通过加诱导物来诱导质粒上的启动子，表达你克隆上去的目的基因。
4、经过软件划分ORF是不完全靠谱的，仅仅可以供参考，因为我曾经在一个来自丝状真菌的基因中找到8个ORF。你据此再克隆做了几个阅读框的表达，那就更加不应该了。
5、正确的方法是亚克隆，这也是我用过的方法。就是选择你的载体上没有但在你的8KB外源片段上有2个或以上的酶切位点，完全酶切，再让切出来的片段之间自连，连接产物中可能存在有活性的克隆，这样就去掉了部分非目的基因的序列。视情况，运气好的时候仅用一个内切酶就获得含很少多余序列的片段，运气差的时候你的目的基因里有很多个内切酶的位点，自连成为正确的序列的概率低，但也可以帮助你定位基因了。

另外，如果楼主已经用PUC19做表达了，请告诉我，我也有此想法，谢谢！
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
13楼2015-11-09 01:42:11
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
14楼: Originally posted by 小科研女dow at 2015-11-09 08:41:22
谢谢你的回复，过了这么久还回复我。
关于这个问题，我们已经解决了，就是表达了其中所有的ORF,幸运的是其中一个很小的500bp左右的ORF是我们要找的活性序列。
祝好~~...

请问你是用pUC19来表达的吗？
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15楼2015-11-09 20:30:51
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
16楼: Originally posted by 小科研女dow at 2015-11-10 09:23:16
筛选的时候是，后来ORF表达不是，选了表达性质粒，pet30a-(+)...

你的基因是通过活性筛选得到的，能在大肠杆菌里表达的，所以可以用带强启动子的质粒来表达，我的是真菌的基因，用带有强启动子的质粒来表达形成了包涵体，没办法，只能试着用弱启动子的pUC19.
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17楼2015-11-10 20:02:11
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