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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建基因文库的方法筛选到阳性克隆，克隆中插入的基因长为8000bp，如何找到目的基因？
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小科研女dow

木虫 (小有名气)

[求助] 构建基因文库的方法筛选到阳性克隆，克隆中插入的基因长为8000bp，如何找到目的基因？ 已有3人参与

各位虫子们，大家好，小虫今天提出一个长久困扰的问题，希望得到大家的建议，先谢过了~
最近做基因文库，采用的PUC19作为载体，将不完全酶切的片段插入该载体中后，转化大肠杆菌DH5α，经过筛选得到阳性克隆，将阳性克隆单菌落培养提取质粒后送去测序公司测序，得到一个片段为8000bp的结果，以下为后续工作中遇到的问题：
1、目的基因应该不至于是8000bp这么大，小虫认为实际的目的片段式这8000bp中的一部分，经过软件划分ORF做了几个阅读框的表达，但是均无活性。
2、PUC19不是表达型质粒，所以没有办法将筛选的重组质粒直接转化到Rosetta和BL-21中大量表达，得不到目的蛋白。
3、曾经见过有人对PUC19做过改造，可以用于表达蛋白，而不是仅仅用来克隆，但是自己经验欠缺，没有这方面的基础。
4、还有人说，可以采用可以启动表达的宿主菌，也只是听说，并未接触过。

楼主主要的目的是在这8000bp中寻觅到真正的目的片段，请问有什么好的意见吗？先谢过了!
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做出色的科研人
1楼 2014-08-28 17:05:27
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小科研女dow

木虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2015-11-09 01:42:11
找东西偶然找到了这个帖子，点开一看，发现时间已经过去挺久了，不知道楼主的事情解决了没有，我仅谈谈我的看法：
1、确实，常见的单体蛋白质的分子量如果有100KD就比较大了，就以这个分子量来计算吧。如果没有内含 ...

谢谢你的回复，过了这么久还回复我。
关于这个问题，我们已经解决了，就是表达了其中所有的ORF,幸运的是其中一个很小的500bp左右的ORF是我们要找的活性序列。
祝好~~
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做出色的科研人
14楼2015-11-09 08:41:22
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小科研女dow(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-29 20:47:19
8000bp？你是测通了吗？
“将不完全酶切的片段插入该载体中后”为什么是不完全酶切而不是完全酶切
还有质粒你跑电泳了吗 与与其的大小是否符合
赞一下 回复此楼
3楼2014-08-29 10:44:54
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小科研女dow

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by happydove at 2014-08-29 10:44:54
8000bp？你是测通了吗？
“将不完全酶切的片段插入该载体中后”为什么是不完全酶切而不是完全酶切
还有质粒你跑电泳了吗 与与其的大小是否符合

不完全酶切这个微生物的基因组，然后建文库。
8000bp是阳性克隆，送给公司公司给测通了
质粒大小正确。
请问有什么办法可以从这8000中缩短片段吗？
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做出色的科研人
4楼2014-08-29 13:19:21
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小科研女dow: 金币+15, ★★★很有帮助 2014-08-30 09:41:00
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-31 19:08:35
一步步做亚克隆，一点点缩短，不要一下就掂出来orf做表达，可能需要几个基因才有活性

[ 发自小木虫客户端 ]
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6楼2014-08-30 09:09:05
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查看全部 18 个回答
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