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阿修罗Axuro金虫 (小有名气)
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十分诡异的电泳问题，已经解决，分享给大家。 已有37人参与
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前几天发了个帖，对于十分诡异的电泳问题的，现在已经解决，找到问题了。 首先，我在那个帖子里一开始就说过了，我做过四年胶了，从来没出过问题。 我也做过各种尝试变换，问题依然没有解决。很多回复的人都把这个问题想得很常规。但是四年做胶经验各种尝试都没解决，应该知道并不是常规的问题。 昨天有一个虫子 @ssssllllnnnn 认为是marker严重过量，建议减少量，做个依次梯度。按建议做完后，发现减少到0.5ul时确实条带比较好了。但是问题随之而来了： 一，marker的说明书建议加5ul，为何5ul会不行？而需要减少到0.5ul。 二，虫子我这四年来，做胶都是加5ul，有时候甚至随手加到10ul，从未出过问题，为何现在5ul不行了？ 三，0.5ul虽然条带比较好，但是根本不能实际应用，因为亮度太弱，如果曝光时间延迟，则PCR产物条带就成了一条巨粗无比的带。 那么这里面肯定有蹊跷。于是我决定把胶切开看看，一探究竟，先横向切开，观察加样孔，发现加样孔十分平滑，毫无问题。 然后纵向切开，用紫外灯照着，观察条带。有了很重要的发现：纵向来看，Marker的条带并不是垂直的一条线，而是弯的。具体见第一张图的示意。由于电泳的条 带在纵向上不是一条垂直线，当我们从上往下观察电泳胶的时候，我们看到的条带就会比较宽的，这样就会形成重叠和拖尾严重的现象。 而减少Marker的量，由于Marker少了，并没有把整个纵向填满，当Marker越少，就填得越低，这样我们看到的条带就越细，这样减少Marker就能获得比较正常而又清晰的条带。但是减少Marker并没有解决我的实验的问题。  上面部分只是解释了这些现象，为什么会这样呢？当我看到我的胶的纵切图的时候，我马上就反应过来了：很明显，胶不均匀，纵向来讲上部分浓度较大，而下部分浓度低，这样上面的DNA跑得慢，下面的跑得快，就形成了这个现象。 想到这里，我马上想到了一个问题：我们做胶和电泳一直是在通风橱里面做，由于我们这栋楼是豆腐渣工程，一直以来，通风橱都是个摆设：没有风。由于很多老师实验要求，几个月前，院里把通风橱的风道修好了，有风了！！！这样再在通风橱里面做胶的话，风比较大，使胶的表面的水分流失很快。这样就导致胶的表面部分浓度较高，而胶下部分浓度变化不大。 想完后，今天马上动手，在通风橱外面做了一块胶，果然不出所料，问题解决了。5ulmarker依然没有问题。见附图二。   20140828.jpg |
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prominetsun
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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有人提出解决方法，楼主一个劲问我觉得很正常啊，不明白才问啊，明白了还上小木虫讨论什么啊，所以追着问才是王道啊！还有有人提出来是胶的问题，可是一群人给意见啊，有的是对的有的是错的，问题没找出来之前谁都不知道哪个对，你也不能随便一个回答不加思考就觉得是对的吧～楼主是粗心，但是这种研究的精神还是值得表扬的，因为在很多科研情况下很多粗心的无心之失细心研究原理反而更易出成就。我觉得没什么不妥的，楼主觉得这是个小问题，觉得楼主是个菜鸟小鄙视了一下，但是等到大问题的时候这种方法就派上大用场了。懂得多没什么了不起的，凭楼主事事求真的性格，假以时日，一定能做出一番成绩的！楼主加油，力挺楼主！ [ 发自小木虫客户端 ] |
31楼2014-08-31 11:20:30
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2楼2014-08-28 15:16:24
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3楼2014-08-28 15:19:31
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4楼2014-08-28 16:04:05
