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阿修罗Axuro金虫 (小有名气)
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十分诡异的电泳问题，已经解决，分享给大家。 已有37人参与
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前几天发了个帖，对于十分诡异的电泳问题的，现在已经解决，找到问题了。 首先，我在那个帖子里一开始就说过了，我做过四年胶了，从来没出过问题。 我也做过各种尝试变换，问题依然没有解决。很多回复的人都把这个问题想得很常规。但是四年做胶经验各种尝试都没解决，应该知道并不是常规的问题。 昨天有一个虫子 @ssssllllnnnn 认为是marker严重过量，建议减少量，做个依次梯度。按建议做完后，发现减少到0.5ul时确实条带比较好了。但是问题随之而来了： 一，marker的说明书建议加5ul，为何5ul会不行？而需要减少到0.5ul。 二，虫子我这四年来，做胶都是加5ul，有时候甚至随手加到10ul，从未出过问题，为何现在5ul不行了？ 三，0.5ul虽然条带比较好，但是根本不能实际应用，因为亮度太弱，如果曝光时间延迟，则PCR产物条带就成了一条巨粗无比的带。 那么这里面肯定有蹊跷。于是我决定把胶切开看看，一探究竟，先横向切开，观察加样孔，发现加样孔十分平滑，毫无问题。 然后纵向切开，用紫外灯照着，观察条带。有了很重要的发现：纵向来看，Marker的条带并不是垂直的一条线，而是弯的。具体见第一张图的示意。由于电泳的条 带在纵向上不是一条垂直线，当我们从上往下观察电泳胶的时候，我们看到的条带就会比较宽的，这样就会形成重叠和拖尾严重的现象。 而减少Marker的量，由于Marker少了，并没有把整个纵向填满，当Marker越少，就填得越低，这样我们看到的条带就越细，这样减少Marker就能获得比较正常而又清晰的条带。但是减少Marker并没有解决我的实验的问题。  上面部分只是解释了这些现象，为什么会这样呢？当我看到我的胶的纵切图的时候，我马上就反应过来了：很明显，胶不均匀，纵向来讲上部分浓度较大，而下部分浓度低，这样上面的DNA跑得慢，下面的跑得快，就形成了这个现象。 想到这里，我马上想到了一个问题：我们做胶和电泳一直是在通风橱里面做，由于我们这栋楼是豆腐渣工程，一直以来，通风橱都是个摆设：没有风。由于很多老师实验要求，几个月前，院里把通风橱的风道修好了，有风了！！！这样再在通风橱里面做胶的话，风比较大，使胶的表面的水分流失很快。这样就导致胶的表面部分浓度较高，而胶下部分浓度变化不大。 想完后，今天马上动手，在通风橱外面做了一块胶，果然不出所料，问题解决了。5ulmarker依然没有问题。见附图二。   20140828.jpg |
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2楼2014-08-28 15:16:24
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-28 17:58:30
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-28 17:58:30
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我在加一点哈，是一个很猛的博士指点的：梳子对胶的影响也挺大，我们过去用厚梳子，配出来的胶单个孔的宽比较大，最后换成薄的，效果有很好的改善，原理跟楼主的差不多，见楼主图2的理论分析。 除此之外，之前我们习惯用单排25孔的梳子，最后改成单排18孔的梳子，把胶配薄一点，跑得效果很不错。现在大家都用这种方案。 我们一般30个循环的PCR点10ul，我点过5ul，带很清晰。 小提高拷贝质粒pGEM的，10ul体系酶切1ul，点5ul的酶切样品，跑得胶效果也很好，我们之前都是全点，现在我习惯点5ul。 |
6楼2014-08-28 17:13:39
阿修罗Axuro
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3楼2014-08-28 15:19:31
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