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jia901铜虫 (小有名气)
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[求助]
T-RFLP分析之后，片段长度为何会出现在系统发育树中，求解答 已有1人参与
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最近看一些文章T-RFLP的分析与克隆文库一起做的，在系统发育树的某条序列后面会列上RF的片段，如图：   方法与图例中均无清晰说明，其中有的说“Clones in bold indicated the dominant T-RFs detected by T-RFLP analysis.” 请了解的大侠能给普及一下，这种是怎么处理的，每条克隆所得序列怎么能与RF的长度联系起来。 谢过！ |
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2楼2014-09-23 13:38:51
peterrjp
铁杆木虫 (著名写手)
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【答案】应助回帖
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这个我以前也做过，也发过类似的文章。T-RFLP的每个峰代表什么微生物，需要做克隆测序才知道。测序用的PCR引物和T-RFLP的最好完全一样（只是不加荧光标记），这样就可以在ChromasPro等软件上根据测序得到的序列预测T-RF片段理论长度（即荧光标记端与最近的酶切位点的距离）。这个理论长度和T-RFLP实际做出来的长度可能会有几个bp的差距。如果你的实验结果里有几个长度很接近的T-RF片段，就很难将它们与测序结果对应上。这时就需要做克隆校正： 克隆测序时挑取的单克隆菌液可以直接用来当作PCR的模版，PCR产物酶切纯化后拿去做T-RFLP，这个T-RFLP图谱理论上只有一个峰，它应该和你之前做的T-RFLP n个峰中的某个峰的位置是一致的，这样就能准确地将测序序列和T-RF片段对应上。 |
3楼2014-10-25 14:41:18
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