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动物组织研磨和裂解问题 已有3人参与
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本人近期欲做western blot，样品是动物胃肠道（四个胃和大小肠）、肾脏、肮脏，研究对象是细胞膜上的一种通道蛋白。由于是第一次做western，有如下问题，希望热心的虫友帮忙， ①我的方法是：先将组织剪碎，并加入适量RIPA裂解液，然后用手持式组织研磨器研磨（实验室没有玻璃匀浆器）。在组织研磨过程中发现，大、小肠黏膜很容易研磨；但是，瘤胃壁、肾脏和肝脏等，用上面方法的就不容易研磨，总是剩余一些组织块，不知道还有没有其他好的方法 ②做过类似的试验的小伙伴们，想问下哪个公司的RIPA裂解液（裂解膜上的蛋白）好些；还有就是用不用加入蛋白酶抑制剂，如PMSF 谢谢各位了 |
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12楼2014-09-30 15:43:53
for5
木虫 (正式写手)
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2楼2014-08-10 09:30:51
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至尊木虫 (知名作家)
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
仲尼(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-10 10:26:40
仲尼: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-08-15 11:38:23
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仲尼: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-08-15 11:38:23
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1、要达到好的匀浆效果，只有用电动式匀浆器。其实肝脏、肾脏应该更容易匀浆，这些组织比较“脆”，而胃肠道则含有大量平滑肌，相对较难些。如果你的蛋白只在胃肠粘膜上皮表达，则可以考虑将胃肠粘膜刮下来。 2、RIPA buffer不需要买，自己配置就可以了，成分简单（网上随便一搜就可以找到配方）。另外尽可能加入蛋白酶抑制剂, 最方便的是Roche公司的cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets （http://labs.mmg.pitt.edu/gjoerup/protease%20inhibitor.pdf）。如果你的目标蛋白是一种磷酸化蛋白，而且与你的研究相关联，则尚需加入磷酸酶抑制剂。 |
3楼2014-08-10 09:40:31
十分感谢！另外，我要检测的是目的蛋白的总量（可能包括磷酸化的和未磷酸化的），这样的话是不是可以不加磷酸化酶抑制剂呢？ 4楼2014-08-10 10:02:57