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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 想要证明一个启动子是受到氧气调控，怎么设计基因敲除？
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wuyundang

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[求助] 想要证明一个启动子是受到氧气调控，怎么设计基因敲除？ 已有1人参与

我们做微生物，想证明一株叫做HS01的嗜水气单胞菌其中一个启动子受到氧气刺激而调控（我们知道这个启动子的序列），即有氧气的时候它就会调控后续基因表达，没有氧气就不表达。
我们应该证明哪几点？
一：要证明氧气可以调控这个启动子
二：要证明氧气不是直接作用在下游序列上，而是启动子上。
我们打算这么做：
1：我们想把这段启动子序列导入到质粒当中，让它调控另一段基因的表达，比如某个显色的基因，看看是不是这个显色基因也受氧气影响，那就证明了这段启动序列是受氧气调控的。即证明第一点。
2：我们想用一个新的启动子，比如受光控制的启动子，与原有的启动子的上下游序列构建一个质粒，即用新启动子代替原来的，然后将这个质粒导入到已敲除原启动序列的HS01当中，得到一株新的敲除菌。新菌不再受氧气调控，而是受光调控，这样就证明了氧气是作用在启动子上，而不是下游序列上。证明第二点。

有个国外实验室给我们回邮件，说可以这么做，我觉得这只能证明我所说的第一点，各位看看：
Alternatively, we can structure a donor plasmid with following sequence(也就是构建一个换掉启动子序列的质粒). and a crispr/cas9 palsmid targets to your regulator. Then ,you transform the plasmids into Aeromonas hydrophila strain s1. You will achieve the purpose of the experiment.

我说的方案需要构建两株突变菌，我说的那样做对吗？有必要那么麻烦吗？
外国实验室这样做，只需要构建一株突变菌，对吗？能证明氧气的调控吗？
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1楼 2014-08-08 15:58:48
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kuaile5420

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2014-08-09 21:27:52
wuyundang: 金币+8, ★★★★★最佳答案 2014-08-12 22:07:18
您好，个人感觉您设计的第二个敲除菌意义不大，感觉重新梳理一下实验思路会好一些。首先我们要明确的是氧气是直接作用在启动子上还是通过相关途径产生某种物质来与启动子结合进行基因调控？这个貌似没有相关文献记载氧气可以直接作用在启动子上，因此是通过相关途径产生某种物质来进行基因调控的。因此要确定的是氧气作用后产生了那个物质。希望这样回答会对您的实验设计有所帮助。期待进一步交流。
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2楼2014-08-08 17:48:16
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wuyundang

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谢谢你的回复。
如果要找到这种刺激启动子的生成物，估计有一定难度吧，不知从何入手。
我们现在主要的第一个目的，就是请国外实验室给我们做几株敲除菌，我们想证明那个启动子确实受到了氧气的影响，你认为应该怎么设计实验呢？我所说的第一个敲除菌有意义吗？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2014-08-09 09:31:00
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kuaile5420

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★ ★ ★ ★ ★
wuyundang(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-10 10:27:05
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-20 09:50:19
引用回帖:
3楼: Originally posted by wuyundang at 2014-08-09 09:31:00
谢谢你的回复。
如果要找到这种刺激启动子的生成物，估计有一定难度吧，不知从何入手。
我们现在主要的第一个目的，就是请国外实验室给我们做几株敲除菌，我们想证明那个启动子确实受到了氧气的影响，你认为应该怎么 ...

第一个敲出菌是有意义的啊，可以通过该显色基因的表达来确定是否氧气对该启动子进行了调控。不知道你用的是那个菌，这里有篇文章，希望对您有帮助。http://wenku.baidu.com/view/1166b559c850ad02de8041df.html 里面提到了氧化应激反应对.http://wenku.baidu.com/view/d1d322d59b89680203d82579.html ,这个Ppt中也说到了氧化应激反应对基因影响效应。你可以查一下相关的文献确定氧气对启动子调控机理，然后进行设计实验。
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wuyundang
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4楼2014-08-10 10:18:27
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wuyundang

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引用回帖:
4楼: Originally posted by kuaile5420 at 2014-08-10 10:18:27
第一个敲出菌是有意义的啊，可以通过该显色基因的表达来确定是否氧气对该启动子进行了调控。不知道你用的是那个菌，这里有篇文章，希望对您有帮助。http://wenku.baidu.com/view/1166b559c850ad02de8041df.html 里 ...

谢谢！
第一个敲除菌方案，不知道把启动子导入到新的菌当中之后，还能不能起到作用？
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5楼2014-08-11 09:47:47
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kuaile5420

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★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-20 09:50:54
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5楼: Originally posted by wuyundang at 2014-08-11 09:47:47
谢谢！
第一个敲除菌方案，不知道把启动子导入到新的菌当中之后，还能不能起到作用？...

您好为什么要导入其他新的菌？新的菌不是该种菌株吧？有些启动子可以在新的菌株中使用，但有些也许根本不能使用呀。给你提供几个方案，你可以参考一下。我们的目的在于检测有无氧气作用是该启动子对相关基因的调控。方案一，我们可以在该菌中该启动子所调控的基因中加入显色基因（利用限制性内切酶酶切然后连接起来），这样就没有改变菌种，可以在有氧和无氧条件下看该基因是否表达显色蛋白来，从而确定有无氧气作用是该启动子对相关基因的调控。方案二，假如我们知道该启动子控制的基因，我们可以利用定量pcr来检测有无氧气是该基因的表达情况的变化。
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6楼2014-08-11 11:23:58
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wuyundang

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引用回帖:
6楼: Originally posted by kuaile5420 at 2014-08-11 11:23:58
您好为什么要导入其他新的菌？新的菌不是该种菌株吧？有些启动子可以在新的菌株中使用，但有些也许根本不能使用呀。给你提供几个方案，你可以参考一下。我们的目的在于检测有无氧气作用是该启动子对相关基因的调控 ...

我们已经用定量pcr检测到这段启动序列之后的基因表达量是增加的，这就可以说明这个启动序列是受氧气调控了吗？
在该启动子后面加入显色基因，可以证明氧气的调控吗？因为我们即使不加入显色基因，它本身含有铬还原基因，氧气存在时，我们可以检测到铬还原就加强了，和显色是类似的。
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7楼2014-08-12 22:10:27
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kuaile5420

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你好，不好意思啊，这一周都在忙实验的事情，现在才给你回复，不知道你现在做到哪里了，做定量PCR是的对照是无氧的吗？你后面说的铬还原基因存在哪里？该启动子后面？
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8楼2014-08-19 21:38:58
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