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guozhongbaono1

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】 我拿什么来拯救你,我的RNA

提RNA也有一段时间了,刚进实验室的时候可能是新手手气好,提的可以,可是年后说死也提不好了,各种试剂、耗材都换了! 我实在没办法了求各位大侠帮帮我吧!!! 要不就毕不了业啦!!!
这是我年前提的图


怎么图片上传不了啊!!!
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快乐是一天,不快乐也是一天,为何不天天快乐昵~~~
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guozhongbaono1

木虫 (正式写手)


大家给点建议好吗???
谢谢先!!!
快乐是一天,不快乐也是一天,为何不天天快乐昵~~~
2楼2008-04-10 09:52:35
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zhangchong121

木虫 (小有名气)

你做的是什么材料,怎么操作的,说清楚些,这样才能帮你分析啊。
3楼2008-04-10 10:37:58
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guozhongbaono1

木虫 (正式写手)

zhangchong121虫友说的有道理啊!!!  谢谢先
所以的试剂、耗材都处理过了(DEPC等)、干热(200度、3小时)、高压灭菌等!
我提的是鱼的组织(肌肉),新鲜样和冻存都做过了。
新鲜样取样后(0.1g),立即放入1ml的Trizol1.5ml的离心管中,用电匀浆器匀浆后按步骤操作:
1.匀浆后静止5min,4度12000转离心10min,取上清于新离心管中。
2.在新管中加入0.2ml的预冷的氯仿,剧烈混匀15秒(手动,呵呵),静止5min,4度12000转离心15min.
3.取上清(宁缺毋滥)加入新管中,加入预冷的0.5ml的异丙醇,混匀(手动),-20度放置40分钟,4度12000转离心10min。
4.之后对沉淀用75%乙醇(现用现配的用DEPC处理过的水)洗涤2次,尽量弃75%乙醇(弃上清再离心!!!)
5.干燥,用DEPC处理过的水溶解,56度水浴6分钟。
6.跑胶:1%的胶,电压120V 20分钟 上样4微升



也不知道写的全面不?
谢谢指点迷津!!!!!!!!!
快乐是一天,不快乐也是一天,为何不天天快乐昵~~~
4楼2008-04-10 11:10:58
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guozhongbaono1

木虫 (正式写手)

怎么没人理我啊!!!!
真的毕不了业了吗
快乐是一天,不快乐也是一天,为何不天天快乐昵~~~
5楼2008-04-10 15:40:28
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edragonfly

新虫 (初入文坛)

愚见!

★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+4,VIP+0):新虫,奖励一下
4.之后对沉淀用75%乙醇(现用现配的用DEPC处理过的水)洗涤2次,尽量弃75%乙醇(弃上清再离心!!!)这一步不知道你离心几分钟,觉得离心时间要是短的反而把贴在壁上的RNA弄下来了 一定要加上这一步的话,离心时间和前面一样 还有就是注意管子的摆放。
5.干燥,用DEPC处理过的水溶解,56度水浴6分钟。
6.跑胶:1%的胶,电压120V 20分钟 上样4微升
生活是一面镜子,所以微笑面对!
6楼2008-04-10 16:05:22
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guozhongbaono1

木虫 (正式写手)

在这里先谢谢虫友 edragonfly 的回帖!!!
我这步骤还真没太注意,离心的话是7500转离心5分钟,是离心2次,这样感觉能更好的弃乙醇,能洗得更干净些吧?(个人见解)
能冒昧的问一下:为什么这步离心的时间和前面一样呢???
快乐是一天,不快乐也是一天,为何不天天快乐昵~~~
7楼2008-04-11 09:12:07
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辛雨237

铁杆木虫 (著名写手)

呵呵
师弟加油啊
春暖花开
8楼2008-04-11 09:20:56
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edragonfly

新虫 (初入文坛)

呵呵  其实残留一点乙醇是没有关系的  其实我的意思就是考虑不要把沉淀的RNA弄掉了 你的步骤没有问题  也换过试剂了 只能是操作哪一步没有注意吧
生活是一面镜子,所以微笑面对!
9楼2008-04-11 19:39:40
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guozhongbaono1

木虫 (正式写手)

   哦  是这样啊  理解错了!
真的找不出原因了!昨天也提了,效果挺好的  也没怎么变化,就是液氮研磨样少了点、上样加1微升、电压130V。效果还可以吧!
终于可以往下做RACE 了,听说RACE也很难做的,希望实验顺利吧!
祈祷!!!
快乐是一天,不快乐也是一天,为何不天天快乐昵~~~
10楼2008-04-11 20:47:50
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