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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助/交流】 我拿什么来拯救你，我的RNA
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guozhongbaono1

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】 我拿什么来拯救你，我的RNA

提RNA也有一段时间了，刚进实验室的时候可能是新手手气好，提的可以，可是年后说死也提不好了，各种试剂、耗材都换了！ 我实在没办法了求各位大侠帮帮我吧！！！ 要不就毕不了业啦！！！
这是我年前提的图


怎么图片上传不了啊！！！
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快乐是一天，不快乐也是一天，为何不天天快乐昵~~~
1楼 2008-04-09 22:11:25
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guozhongbaono1

木虫 (正式写手)

大家给点建议好吗？？？
谢谢先！！！
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快乐是一天，不快乐也是一天，为何不天天快乐昵~~~
2楼2008-04-10 09:52:35
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zhangchong121

木虫 (小有名气)
你做的是什么材料，怎么操作的，说清楚些，这样才能帮你分析啊。
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3楼2008-04-10 10:37:58
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guozhongbaono1

木虫 (正式写手)
zhangchong121虫友说的有道理啊！！！  谢谢先
所以的试剂、耗材都处理过了（DEPC等）、干热（200度、3小时）、高压灭菌等！
我提的是鱼的组织（肌肉），新鲜样和冻存都做过了。
新鲜样取样后（0.1g），立即放入1ml的Trizol1.5ml的离心管中，用电匀浆器匀浆后按步骤操作：
1.匀浆后静止5min,4度12000转离心10min，取上清于新离心管中。
2.在新管中加入0.2ml的预冷的氯仿，剧烈混匀15秒（手动，呵呵），静止5min，4度12000转离心15min.
3.取上清（宁缺毋滥）加入新管中，加入预冷的0.5ml的异丙醇，混匀（手动），-20度放置40分钟，4度12000转离心10min。
4.之后对沉淀用75%乙醇（现用现配的用DEPC处理过的水）洗涤2次，尽量弃75%乙醇（弃上清再离心！！！）
5.干燥，用DEPC处理过的水溶解，56度水浴6分钟。
6.跑胶：1%的胶，电压120V 20分钟 上样4微升



也不知道写的全面不？
谢谢指点迷津！！！！！！！！！
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4楼2008-04-10 11:10:58
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guozhongbaono1

木虫 (正式写手)
怎么没人理我啊！！！！
真的毕不了业了吗
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5楼2008-04-10 15:40:28
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edragonfly

新虫 (初入文坛)

愚见！

★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+4,VIP+0):新虫,奖励一下
4.之后对沉淀用75%乙醇（现用现配的用DEPC处理过的水）洗涤2次，尽量弃75%乙醇（弃上清再离心！！！）这一步不知道你离心几分钟，觉得离心时间要是短的反而把贴在壁上的RNA弄下来了 一定要加上这一步的话，离心时间和前面一样 还有就是注意管子的摆放。
5.干燥，用DEPC处理过的水溶解，56度水浴6分钟。
6.跑胶：1%的胶，电压120V 20分钟 上样4微升
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生活是一面镜子，所以微笑面对！
6楼2008-04-10 16:05:22
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guozhongbaono1

木虫 (正式写手)
在这里先谢谢虫友 edragonfly 的回帖！！！
我这步骤还真没太注意，离心的话是7500转离心5分钟，是离心2次，这样感觉能更好的弃乙醇，能洗得更干净些吧？（个人见解）
能冒昧的问一下：为什么这步离心的时间和前面一样呢？？？
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7楼2008-04-11 09:12:07
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辛雨237

铁杆木虫 (著名写手)
呵呵
师弟加油啊
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春暖花开
8楼2008-04-11 09:20:56
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edragonfly

新虫 (初入文坛)
呵呵  其实残留一点乙醇是没有关系的  其实我的意思就是考虑不要把沉淀的RNA弄掉了 你的步骤没有问题  也换过试剂了 只能是操作哪一步没有注意吧
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生活是一面镜子，所以微笑面对！
9楼2008-04-11 19:39:40
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guozhongbaono1

木虫 (正式写手)
   哦  是这样啊  理解错了！
真的找不出原因了！昨天也提了，效果挺好的  也没怎么变化，就是液氮研磨样少了点、上样加1微升、电压130V。效果还可以吧！
终于可以往下做RACE 了，听说RACE也很难做的，希望实验顺利吧！
祈祷！！！
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10楼2008-04-11 20:47:50
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