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梦梦神

新虫 (初入文坛)

[求助] 溶解曲线不好荧光定量pcr的数据就用不了吗? 已有6人参与

溶解曲线不好荧光定量pcr的数据就用不了吗?
溶解曲线不好荧光定量pcr的数据就用不了吗?-1[/img]
以PCR产物纯化后为模板进行荧光定量PCR,目的基因nxrB,如图
1溶解曲线的这两个杂峰第一个是二聚体第二个是非特异性扩增是吗?
2我退火温度从55提高一直到这次的63度,引物浓度也减半了(到5uM)可二聚体还是存在,这种情况该怎么优化实验条件?
3引物序列是根据文献上应该说比较成熟了的来合成的,看到些帖子说是污染了,在不重提DNA前提下有哪些地方可以优化的呢?
4扩增曲线看还是可以的,但是不是溶解曲线不好数据就完全用不了啊?
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yangxy04

金虫 (小有名气)

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-20 16:57:27
溶解曲线显示有非特异性扩增,由于SYBRGREEN法的特点,引物二聚体和非特异扩增的结果都会导致Ct值不可信。
建议题主不愿意更换引物可以从以下几点进行优化:
1、降低反应体系中的引物浓度。
2、采用三步法进行反应。
3、可以考虑更换PCR mix试试。
12楼2014-08-20 16:28:51
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
把PCR产物连到T载体上去测个序,如果测序结果不错就qPCR结果就可以用
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
2楼2014-08-06 11:17:10
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
产物不纯可信度差
3楼2014-08-06 11:30:42
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
梦梦神(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-06 13:15:56
梦梦神: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-07 16:39:54
1.是的,解决方法:将现有引物稀释100倍试一下或者重新设计引物
2,引物稀释100倍:
3,可以重新设计引物
4,溶解曲线这个样子说明有非特异性扩增,qPCR本身就是非常灵敏的实验,这个数据是不可信的
4楼2014-08-06 12:34:23
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