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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助 转基因鉴定实验
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xgyun1018

银虫 (小有名气)

[交流] 求助 转基因鉴定实验

各位大虾，我成功将基因利用农杆菌浸染方法转化进拟南芥，但是在T0代鉴定阳性植株的时候出现了问题，特地各位请教。大致情况是这样的。

我将所提取的RNA反转录得到cDNA，同时做了一个对照，两管唯一的区别就是对照的管中未加反转录酶。我分别利用这两管做模板进行PCR扩增（引物为克隆目的基因时所用引物），结果两个均可以扩增出目的基因大小的条带，并且对照那管的条带亮度比cDNA做模板的条带要亮，我重复了3次均是这样。一直未找到合理的解释。

今天我又将对照的那管补加上反转录酶，并且75度10分钟，然后做模板进行PCR，结果跟以前的一样，还是比cDNA做模板亮！人快疯了！

希望大哥大姐们多多指点小弟啊，谢谢谢谢

[ Last edited by 350784478 on 2009-7-12 at 09:21 ]
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1楼 2008-04-09 14:47:47
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叶子sunny

新虫 (初入文坛)
和我遇到的问题类似，不知道你现在找到解决方案了没？？
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2楼2008-08-23 17:34:53
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snow889

提取的RNA又没有经过DNA酶的处理？我觉得你的RNA样品可能污染了DNA。
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3楼2008-08-24 00:38:10
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gaowei706

铁杆木虫 (职业作家)

资深潜水者
你转的是什么基因？是拟南芥本身的吗？你的提RNa用的什么方法？你的PCR体系是不是污染了?
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逐渐失去棱角
4楼2008-08-24 10:21:31
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gaowei706

铁杆木虫 (职业作家)

资深潜水者
你用什么作的对照也没说清楚
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逐渐失去棱角
5楼2008-08-24 10:22:23
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bioxy

木虫 (初入文坛)
我也觉得DNA污染的可能性比较大，用DNase I处理一下看看
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6楼2008-08-26 15:35:32
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
明显是DNA污染 有基因组DNA的存在
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7楼2008-08-27 11:48:09
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lipishun

金虫 (小有名气)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复
DNA污染的可能性比较大,应该用个没有转基因的植株做对照!
你是看转基因的表达情况吗?
如果不是直接用总DNA或者SOUTHERN 都可以鉴定阳性植株的! 为什么要反转呢?
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8楼2008-08-27 20:48:05
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xipha

木虫 (正式写手)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复
你的这段基因可能正好没有内含子，所以cDNA和DNA序列一致，用引物扩增得到相同条带，而由于DNA没有去干净，所以扩得出来，至于亮度问题，很可能是由于提取的RNA没有混匀，碰巧对照管中的基因量比较大。
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9楼2008-08-31 16:51:14
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