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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细菌基因组DNA提取，大家快来帮我啊
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bomeijuan

银虫 (小有名气)

[交流] 细菌基因组DNA提取，大家快来帮我啊

大家快来帮我吧。我是用TIANGEN的细菌基因组DNA提取试剂盒提取的猪的肠道微生物，严格按照操作步骤提取的，提完后测了浓度是100ng/ul左右，后来跑了个0.8%的琼脂糖凝胶电泳。条带很弥散。
查了资料说这样的情况是由于DNA降解了，但是我是溶菌酶也加了，RNA酶也加了，而且配制溶菌酶的缓冲液里面有EDTA，应该能螯合阳离子，从而阻止DNA活性才是啊，DNA还那么容易降解吗？很不明白原因出在哪里，大家快来帮我吧，我都整晕了！
DNA图片如下，1KB的marker，电泳时间1个小时，估计电泳槽为20cm左右，所以电压打到90v。
http://freep.cn/p.aspx?u=v20__p_0804091346165168_0.jpg
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1楼 2008-04-09 13:52:11
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bomeijuan

银虫 (小有名气)

这样的DNA再PCR

我把这次提取的DNA 做了PCR，是按我们实验室的标准程序做的。图片见下，有隐约条带，但是都不是目的条带，目的条带在200bp左右，但是这些条带都在100以下。我用的marker是100bp的。2%的胶。
http://p14.freep.cn/p.aspx?u=v20_p14_p_0804091353409180_0.jpg

[ Last edited by bomeijuan on 2008-4-9 at 13:57 ]
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2楼2008-04-09 13:55:47
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xxh8372

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫微笑研究僧
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
提取ＤＮＡ的问题：

好像还有一些ＲＮＡ，不知道你提取的后用boiled RNase A处理了多久

还有就是你提取的是肠道微生物，这有很多种类，它们的ＤＮＡ的大小肯定是大小不一，还有就是你提取的时候也有可能把肠道微生物的质粒也提取了出来，如此说来，就会出现你图里面的情况

建议你用基因组ＤＮＡ提取的常规方法提取一下，因为不一定试剂盒比常规方法好，而且这样还可以做一对照看

[ Last edited by xxh8372 on 2008-4-9 at 14:10 ]
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3楼2008-04-09 14:08:05
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xxh8372

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫微笑研究僧
引用回帖:
Originally posted by bomeijuan at 2008-4-9 13:55:
我把这次提取的DNA 做了PCR，是按我们实验室的标准程序做的。图片见下，有隐约条带，但是都不是目的条带，目的条带在200bp左右，但是这些条带都在100以下。我用的marker是100bp的。2%的胶。
[url]http://p14.fre ...

不知道你是扩增什么基因，看样子你的图里面都是引物二聚体

像这样从诸多的基因组（很多种微生物的）中扩增一个基因是比较困难的，祝楼主好运
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4楼2008-04-09 14:14:11
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bomeijuan

银虫 (小有名气)
可是我们实验室都是这么做的，大家都能做出来，但是我这样的问题大家却解决不了。
请教一个虫友，她做的跟我差不多，就是实验动物不一样，她说用手工提了两个月没有好的效果，改用试剂盒效果就比较好了，她也是用AXYGEN的。
我的PCR是用细菌通用18S引物扩增的V3-V7区，发个别人做出来的图片看下，如下，人家的的都是200bp左右，而且都只是清晰的一条带，这还不是最好的效果，好的效果，目的条带相当清晰。



[ Last edited by bomeijuan on 2008-4-9 at 19:14 ]
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5楼2008-04-09 14:25:33
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xxh8372

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫微笑研究僧
没有看到图片
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6楼2008-04-09 14:47:14
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lijack

金虫 (初入文坛)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):虫友很热情,也很幽默, 希望别人误解你的意思
你是交大赵教授实验室的吧，他对同行不太友好。（纯属个人意见）
但我还是告诉mm你一个绝招：把DNA稀释10-100倍，重新做PCR，用Qiagen热启动酶，加入Q-sollution，保证行。
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7楼2008-04-09 21:26:25
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bomeijuan

银虫 (小有名气)
我不是交大的，中科院
真的行吗
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8楼2008-04-10 09:02:54
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lijack

金虫 (初入文坛)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):积极交流奖
告诉你原因吧，粪便DNA如纯度不高，往往含有PCR抑制剂，对付抑制剂的处理方法有两种，一是再纯化，对你来说不现实，二就是稀释抑制剂的浓度，所以让你稀释，我的学生以前做人粪便DNA时，就这么教她成功的。
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9楼2008-04-10 09:56:32
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edragonfly

新虫 (初入文坛)
嗯 楼上分析的很有道理 长见识了
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生活是一面镜子，所以微笑面对！
10楼2008-04-10 16:35:52
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