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崔永霞

铁虫 (小有名气)

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[求助] X33菌落PCR 已有4人参与

请教各位高手，我最近在做酵母X33电击转化，转化后的X33涂到带有ZEOCIN抗生素的YPD平板上时，三天后长出单菌落，我用宝生物买的lysis buffer 破壁X33释放基因组DNA，然后离心取上清液做菌落PCR, 都没有条带，总共有47个单菌落（我做了六次电击转化，涂了30个板总计），难道这47个单菌落都是假阳性吗？有没有其他可能呢，我还把单菌落挑到5ml生物YPD+Zeocin液体培养基中培养，然后把过夜培养也生长的送去测序都没测出结果，求各位高手指点。

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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！

1楼 2014-07-31 09:40:48

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shyh1983

金虫 (小有名气)

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引用回帖:

9楼: Originally posted by 崔永霞 at 2014-08-01 09:05:48
首先，非常感谢你的回复。有几个问题还想请教一下：1：47个菌用zeocin 梯度筛选是怎么个做法？ 2：我送的是菌液，测序结果单里面说的是测序反应失败，而且我也在测序单上备注了这是毕赤酵母X33菌液。3：我是转了六 ...

zeocin 梯度筛选：可以把47个转化子用牙签挑到已加入200ulYPD液体的96孔板中（可以加入100ug/mlzeocin，也可以不加，如不加，操作注意无菌），30℃培养2-3天。在将此培养菌液稀释40倍，取1ul点在0.25、0.5、1.0、2.0mg/ml zeocin的YPD板上，培养2-3天观察转化子在各梯度上的生长情况。鉴于你的转化子较少，建议可以先点在0.5上筛，如果筛到，再在1.0上筛，如果0.5上筛不到，则在0.25上筛。最后将筛到的做PCR鉴定。不建议送酵母菌液测序，只要你的表达质粒测序鉴定是对的，酵母转化子PCR鉴定也是对的，一般都没问题。当然，如果实在想测，建议提取基因组送去测。