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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 阴离子DEAE纯化酶，洗脱峰毛刺儿，洗脱后还有毛刺儿，希望得到中间条带的样品
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dongjiqiao

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 阴离子DEAE纯化酶，洗脱峰毛刺儿，洗脱后还有毛刺儿，希望得到中间条带的样品 已有2人参与

如图，希望得到如电泳中9号样品中的条带，但是它是在穿透峰后期出现的，在我的洗脱峰前期（31号）也是这样的样品，上样缓冲液：pH 7.0  Tris-Hcl 0.02M+Nacl 0.02M ,洗脱缓冲液pH 7.0  Tris-Hcl 0.02M+Nacl 1.0 M,梯度洗脱，请问，什么办法能够得到我想要的目的条带，另：上样缓冲液中添加一定的盐，影响不大吧，本人新手，我是问了负责仪器的老师，他说可以少加点，减少疏水作用。缓冲液没有抽滤脱气，超声10min。谢谢大神们指教！阴离子DEAE纯化酶，洗脱峰毛刺儿，洗脱后还有毛刺儿，希望得到中间条带的样品
IMG_0510.JPG
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long,longlong.
1楼 2014-07-30 10:09:47
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dongjiqiao

铁杆木虫 (著名写手)
为什么没人来帮忙哇
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long,longlong.
2楼2014-07-30 15:29:11
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dongjiqiao: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-07-30 17:24:12
youlinglyw: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-07-30 17:55:29
毛刺表示紫外灯不稳定，洗脱峰出现悬崖峭壁表示进空气。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
3楼2014-07-30 16:44:35
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dongjiqiao

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2014-07-30 16:44:35
毛刺表示紫外灯不稳定，洗脱峰出现悬崖峭壁表示进空气。

紫外灯不稳定可能是有什么原因呢？进空气是因为缓冲液没有抽滤，是吧？这样的话，前边洗脱出来的结果还具有可信性么？大神，看到你回复了好多这方面的帖子了，请指教哇！
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long,longlong.
4楼2014-07-30 17:23:44
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dongjiqiao

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2014-07-30 16:44:35
毛刺表示紫外灯不稳定，洗脱峰出现悬崖峭壁表示进空气。

啊， 我刚才回复的内容丢了哇！大神，紫外灯不稳定是为什么呢？进空气是因为缓冲液没抽滤的原因么？大神，请指教！
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long,longlong.
5楼2014-07-30 17:26:13
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
youlinglyw: 金币+2 2014-07-30 17:55:36
youlinglyw: 金币+3, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-08-01 10:01:25
我觉得很奇怪，你都还没有开始洗脱，就有两个大峰出来了，洗脱的过程中反而没有什么峰。而且你的程序为什么设定用洗脱缓冲液洗脱的时间占了程序时间的一半？当然，层析所用的任何液体都是要用0.45微米的滤膜抽滤除去固体颗粒的，以免堵塞填料和其它。紫外灯的问题反而不要紧，因为就现在的图看来还是可以满足需求的。
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6楼2014-07-30 17:53:18
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dongjiqiao

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2014-07-30 17:53:18
我觉得很奇怪，你都还没有开始洗脱，就有两个大峰出来了，洗脱的过程中反而没有什么峰。而且你的程序为什么设定用洗脱缓冲液洗脱的时间占了程序时间的一半？当然，层析所用的任何液体都是要用0.45微米的滤膜抽滤除去 ...

关于洗脱前的出峰问题，应该是因为我进样进了两次，这是两个穿透峰，样品浓度较高，没有吸附到柱子上，都直接穿透出来了；关于洗脱时间，第一次做，不知道什么时候全部洗脱下来，这不是看后面还有悬崖峭壁峰么，怕是还有样品能下托下来，所以时间略长。洗脱开始的时间，是不是应该等穿透峰开始降了，立马就梯度洗脱呢？我是不是应该多设几个梯度进行洗脱，比如，0-0.2M 10个柱体积，0.2-0.6M 10个柱体积这样子？
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long,longlong.
7楼2014-07-31 11:08:19
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
youlinglyw: 金币+3, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-08-01 10:01:32
引用回帖:
7楼: Originally posted by dongjiqiao at 2014-07-31 11:08:19
关于洗脱前的出峰问题，应该是因为我进样进了两次，这是两个穿透峰，样品浓度较高，没有吸附到柱子上，都直接穿透出来了；关于洗脱时间，第一次做，不知道什么时候全部洗脱下来，这不是看后面还有悬崖峭壁峰么，怕 ...

你这个是实验机器可以自动混合制作连续线性梯度的，你能不能再做一次？因为我觉得在洗脱梯度里面的峰太诡异。

应该等穿透峰降下来，基线平稳，才进行梯度洗脱。先尝试0-1M。

你这个目标蛋白质能够用什么方法来检测，是酶吗？
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8楼2014-07-31 20:23:55
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dongjiqiao: 金币+5 2014-08-01 09:50:44
youlinglyw: 金币+3, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-08-01 10:01:38
感觉柱子里有气泡，用缓冲液多冲几次，看能不能将汽泡冲出来，还有我认为线性洗脱分离不好，用手动梯度洗脱，每次曾加5%的盐浓度。

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9楼2014-08-01 07:44:14
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dongjiqiao

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yuanbo934 at 2014-08-01 07:44:14
感觉柱子里有气泡，用缓冲液多冲几次，看能不能将汽泡冲出来，还有我认为线性洗脱分离不好，用手动梯度洗脱，每次曾加5%的盐浓度。

好的，谢谢！
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long,longlong.
10楼2014-08-01 09:50:40
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