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博克侬浮码

银虫 (小有名气)

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专业: 病原微生物变异与耐药

[求助] 克隆问题已有6人参与

想请教前辈们一个问题，就是克隆的时候用的是单酶切，质粒和目的片段都用同一种酶切开，连接也连接上了，但是却怎么都不表达，请问有没有可能是连接后目的片段的复制方向和质粒的复制方向相反，也就是目的片段的启动子和质粒复制时的启动子方向相反导致不表达，如果真是这种情况，该怎样做才能让他们的启动子方向一致，请前辈们多多赐教

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1楼2014-07-28 10:40:30

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usky_4

银虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-07-28 20:16:46
博克侬浮码: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2014-07-30 10:40:00

自然是有可能。你可以用定向PCR来试一下，不用浪费测序的钱，而且也很迅速。最好是在涂板之后挑多个单菌落做，如果已经提了质粒，也可以用质粒做模板。当然要多测几个，因为理论上连接正确的概率是50%，考虑载体自连的话正确率要比这个低得多。

做PCR的引物组合有两种：1. 载体上游引物+目的基因下游引物；2. 目的基因上游引物+载体下游引物。

这样子，只有当你基因片段的阅读顺序和载体同向才可以得到PCR产物，反向的话就无法扩增。之后把能扩增的提质粒送去测序吧，不测序实在是不靠谱的。