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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆问题
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博克侬浮码

银虫 (小有名气)

[求助] 克隆问题 已有6人参与

想请教前辈们一个问题，就是克隆的时候用的是单酶切，质粒和目的片段都用同一种酶切开，连接也连接上了，但是却怎么都不表达，请问有没有可能是连接后目的片段的复制方向和质粒的复制方向相反，也就是目的片段的启动子和质粒复制时的启动子方向相反导致不表达，如果真是这种情况，该怎样做才能让他们的启动子方向一致，请前辈们多多赐教
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1楼 2014-07-28 10:40:30
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
博克侬浮码(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-28 11:14:15
博克侬浮码: 金币+2, ★有帮助 2014-07-30 10:39:28
难道没有测序确定方向？那可真够大胆的。
赶紧测序看一下，如果反了就重新链接、测序验证。无他法。
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2楼2014-07-28 10:46:55
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
博克侬浮码: 金币+2, ★有帮助 2014-07-30 10:39:38
强烈建议多选几个克隆测序
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做一个阳光、开朗的小和尚
3楼2014-07-28 11:48:46
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
博克侬浮码: 金币+2, ★有帮助 2014-07-30 10:39:48
多挑几个送测序，妥妥的
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4楼2014-07-28 14:37:01
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-28 15:21:16
如果你的目的片段较大的话，可以通过酶切验证来进行分别正反向。
如果有点小，就不好分辨，那就测序吧。
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5楼2014-07-28 15:02:27
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华胥调

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为啥不用双酶切？很把握也省钱啊。

[ 发自小木虫客户端 ]
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6楼2014-07-28 16:09:17
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-07-28 20:16:46
博克侬浮码: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2014-07-30 10:40:00
自然是有可能。你可以用定向PCR来试一下，不用浪费测序的钱，而且也很迅速。最好是在涂板之后挑多个单菌落做，如果已经提了质粒，也可以用质粒做模板。当然要多测几个，因为理论上连接正确的概率是50%，考虑载体自连的话正确率要比这个低得多。

做PCR的引物组合有两种：1. 载体上游引物+目的基因下游引物；2. 目的基因上游引物+载体下游引物。

这样子，只有当你基因片段的阅读顺序和载体同向才可以得到PCR产物，反向的话就无法扩增。之后把能扩增的提质粒送去测序吧，不测序实在是不靠谱的。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
7楼2014-07-28 19:42:51
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博克侬浮码

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-28 19:42:51
自然是有可能。你可以用定向PCR来试一下，不用浪费测序的钱，而且也很迅速。最好是在涂板之后挑多个单菌落做，如果已经提了质粒，也可以用质粒做模板。当然要多测几个，因为理论上连接正确的概率是50%，考虑载体自连 ...

谢谢啊，太受用了，多交流
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8楼2014-07-30 10:38:53
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