应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助关于转化
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
91/1返回列表
查看: 165  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

clf0803

银虫 (正式写手)

[交流] 求助关于转化

各位高手，我目前正在做双酶切连接和转化。我用的的酶是takara的NdeI和HindIII，采用37度Kbuffer中双酶切6h，16度连接过夜，转化后涂amp板，可是却长出了一大片（非单菌落），空白对照也长出一片，以致不知如何检测！以前我做转化时都长少量的单菌落，这次不知问题出在哪里？
      还有，请问各位在做转化时，质粒和DNA的比例一般是多少啊？我的DNA基因为1.5kbp，质粒5.4kbp。


      谢谢大家！
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2008-04-07 13:43:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

long0553299

不知道你的培养的抗生素可失效了.
还有可能是你的酶切没切好,建议做两个单酶切的鉴定,确保你的载体可以切开.
质粒和DNA的胶回收产物的比例要根据你的回收产物的浓度定,正常情况下,15ul体系中质粒2ul,DNA5ul就可以了,基本没有失败过!
不知对你是否有用!
赞一下 回复此楼
2楼2008-04-07 14:01:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

weiwei1

木虫 (小有名气)
是不是酶切不完全？一般DNA基因：质粒=5~10：1就可以，摩尔浓度。
赞一下 回复此楼
3楼2008-04-07 15:24:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
1抗生素可能坏掉了
2 下次涂板多做几个梯度。
赞一下 回复此楼
4楼2008-04-07 17:46:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fengyan

木虫 (小有名气)
这一次做平板的时候加氨苄的时候是不是温度太高？
另：下一次可以把菌稀释一下再涂试试
赞一下 回复此楼
5楼2008-04-07 19:24:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

clf0803

银虫 (正式写手)
再问一下，酶切之后，以及连接后需要纯化回收吗？20微升的体系，怎么回收阿？
赞一下 回复此楼
6楼2008-04-07 19:26:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

elvias

铁杆木虫 (正式写手)
载体酶切要回收，目的片段酶切和连接产物不用回收。
赞一下 回复此楼
7楼2008-04-07 19:46:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaohehc371

铁虫 (初入文坛)
我做双酶切的步骤一般是：
1、将基因先连接到T-载体上，这样做的好处是：（1）在双酶切后，跑胶就可以很明显的看出是否切开了；（2）以后再p基因时，可以直接从质粒上p，没必要提基因组DNA了；

2、用试剂盒提T－载体（含目的基因），然后进行酶切，100ul反应体系，跑胶确认完全酶切后用试剂盒回收；

3、过夜酶连；

4、转化，涂Amp平板，挑转化子；

5、抽质粒，跑胶，看大小是否正确；然后pcr验证，测序验证；

6、over
赞一下 回复此楼
8楼2008-04-07 19:50:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 clf0803 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 070305高分子化学与物理 304分求调剂 +7 c297914 2026-03-28 7/350 2026-03-29 01:17 by 544594351
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +6 崔wj 2026-03-26 6/300 2026-03-29 01:11 by hanserlol
[考研] 调剂求院校招收 +5 鹤鲸鸽 2026-03-28 5/250 2026-03-29 01:10 by 我是小康
[考研] 调剂310 +7 温柔的晚安 2026-03-25 8/400 2026-03-29 01:09 by 我是小康
[考研] 348求调剂 +3 小懒虫不懒了 2026-03-28 3/150 2026-03-29 00:39 by 544594351
[考研] 085600 材料与化工 329分求调剂 +10 Mr. Z 2026-03-25 10/500 2026-03-29 00:34 by 我是小康
[考研] 085701求调剂初试286分 +4 secret0328 2026-03-28 4/200 2026-03-28 21:09 by 15366876211
[考研] 312，生物学求调剂 +3 小译同学abc 2026-03-28 3/150 2026-03-28 15:32 by 落睿可思
[考研] 0856求调剂 +11 zhn03 2026-03-25 12/600 2026-03-28 13:32 by 唐沐儿
[考研] 085600 286分 材料求调剂 +7 麻辣鱿鱼 2026-03-27 8/400 2026-03-28 12:17 by zllcz
[考研] 材料求调剂 一志愿哈工大总分298分，前三科223分 +5 dongfang59 2026-03-27 5/250 2026-03-28 04:53 by wxiongid
[考研] 315分求调剂 +7 26考研上岸版26 2026-03-26 7/350 2026-03-28 04:05 by fmesaito
[考研] 307求调剂 +8 超级伊昂大王 2026-03-24 9/450 2026-03-27 15:34 by 超级伊昂大王
[考研] 333求调剂 +3 question挽风 2026-03-23 3/150 2026-03-27 11:29 by 不吃魚的貓
[考研] 一志愿郑大085600，310分求调剂 +5 李潇可 2026-03-26 5/250 2026-03-27 11:14 by 不吃魚的貓
[考研] 359求调剂 +4 王了个楠 2026-03-25 4/200 2026-03-27 08:43 by 不吃魚的貓
[考研] 352求调剂 +4 大米饭！ 2026-03-22 4/200 2026-03-26 16:40 by 不吃魚的貓
[考研] 263求调剂 +6 yqdszhdap－ 2026-03-22 10/500 2026-03-26 13:11 by 公瑾逍遥
[考研] 材料专硕找调剂 +5 哈哈哈吼吼吼哈 2026-03-23 5/250 2026-03-24 19:07 by 了了了了。。
[考研] 361求调剂 +3 Glack 2026-03-22 3/150 2026-03-23 22:03 by fuyu_
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭