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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助关于转化
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clf0803

银虫 (正式写手)

[交流] 求助关于转化

各位高手，我目前正在做双酶切连接和转化。我用的的酶是takara的NdeI和HindIII，采用37度Kbuffer中双酶切6h，16度连接过夜，转化后涂amp板，可是却长出了一大片（非单菌落），空白对照也长出一片，以致不知如何检测！以前我做转化时都长少量的单菌落，这次不知问题出在哪里？
      还有，请问各位在做转化时，质粒和DNA的比例一般是多少啊？我的DNA基因为1.5kbp，质粒5.4kbp。


      谢谢大家！
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1楼 2008-04-07 13:43:51
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long0553299

不知道你的培养的抗生素可失效了.
还有可能是你的酶切没切好,建议做两个单酶切的鉴定,确保你的载体可以切开.
质粒和DNA的胶回收产物的比例要根据你的回收产物的浓度定,正常情况下,15ul体系中质粒2ul,DNA5ul就可以了,基本没有失败过!
不知对你是否有用!
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2楼2008-04-07 14:01:35
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weiwei1

木虫 (小有名气)
是不是酶切不完全？一般DNA基因：质粒=5~10：1就可以，摩尔浓度。
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3楼2008-04-07 15:24:39
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
1抗生素可能坏掉了
2 下次涂板多做几个梯度。
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4楼2008-04-07 17:46:49
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fengyan

木虫 (小有名气)
这一次做平板的时候加氨苄的时候是不是温度太高？
另：下一次可以把菌稀释一下再涂试试
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5楼2008-04-07 19:24:05
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clf0803

银虫 (正式写手)
再问一下，酶切之后，以及连接后需要纯化回收吗？20微升的体系，怎么回收阿？
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6楼2008-04-07 19:26:01
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
载体酶切要回收，目的片段酶切和连接产物不用回收。
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7楼2008-04-07 19:46:34
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xiaohehc371

铁虫 (初入文坛)
我做双酶切的步骤一般是：
1、将基因先连接到T-载体上，这样做的好处是：（1）在双酶切后，跑胶就可以很明显的看出是否切开了；（2）以后再p基因时，可以直接从质粒上p，没必要提基因组DNA了；

2、用试剂盒提T－载体（含目的基因），然后进行酶切，100ul反应体系，跑胶确认完全酶切后用试剂盒回收；

3、过夜酶连；

4、转化，涂Amp平板，挑转化子；

5、抽质粒，跑胶，看大小是否正确；然后pcr验证，测序验证；

6、over
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8楼2008-04-07 19:50:41
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