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clf0803

银虫 (正式写手)

[交流] 求助关于转化

各位高手,我目前正在做双酶切连接和转化。我用的的酶是takara的NdeI和HindIII,采用37度Kbuffer中双酶切6h,16度连接过夜,转化后涂amp板,可是却长出了一大片(非单菌落),空白对照也长出一片,以致不知如何检测!以前我做转化时都长少量的单菌落,这次不知问题出在哪里?
      还有,请问各位在做转化时,质粒和DNA的比例一般是多少啊?我的DNA基因为1.5kbp,质粒5.4kbp。


      谢谢大家!
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long0553299

不知道你的培养的抗生素可失效了.
还有可能是你的酶切没切好,建议做两个单酶切的鉴定,确保你的载体可以切开.
质粒和DNA的胶回收产物的比例要根据你的回收产物的浓度定,正常情况下,15ul体系中质粒2ul,DNA5ul就可以了,基本没有失败过!
不知对你是否有用!
2楼2008-04-07 14:01:35
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weiwei1

木虫 (小有名气)

是不是酶切不完全?一般DNA基因:质粒=5~10:1就可以,摩尔浓度。
3楼2008-04-07 15:24:39
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

1抗生素可能坏掉了
2 下次涂板多做几个梯度。
4楼2008-04-07 17:46:49
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fengyan

木虫 (小有名气)

这一次做平板的时候加氨苄的时候是不是温度太高?
另:下一次可以把菌稀释一下再涂试试
5楼2008-04-07 19:24:05
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clf0803

银虫 (正式写手)

再问一下,酶切之后,以及连接后需要纯化回收吗?20微升的体系,怎么回收阿?
6楼2008-04-07 19:26:01
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

载体酶切要回收,目的片段酶切和连接产物不用回收。
7楼2008-04-07 19:46:34
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xiaohehc371

铁虫 (初入文坛)

我做双酶切的步骤一般是:
1、将基因先连接到T-载体上,这样做的好处是:(1)在双酶切后,跑胶就可以很明显的看出是否切开了;(2)以后再p基因时,可以直接从质粒上p,没必要提基因组DNA了;

2、用试剂盒提T-载体(含目的基因),然后进行酶切,100ul反应体系,跑胶确认完全酶切后用试剂盒回收;

3、过夜酶连;

4、转化,涂Amp平板,挑转化子;

5、抽质粒,跑胶,看大小是否正确;然后pcr验证,测序验证;

6、over
8楼2008-04-07 19:50:41
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