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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 利用单酶切自连（小片段串联）方案
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zhenzhen0216

新虫 (初入文坛)

[求助] 利用单酶切自连（小片段串联）方案 已有1人参与

想表达一段基因，由于序列片段较小，想进行串联表达方案，看到有的资料说可以在目的片段的两端用同一个酶切位点，单酶切下目的片段后自连一段时间再连到同样单酶切的载体上，可以得到不同重复个数的串联表达体，有这样做过的么？切下来的片段如何进行自连？直接回收后放着就行？还是加链接酶？还有单酶切的载体不会发生自连么？怎么预防自连促进目的片段的插入？想做串联3个的方案，或谁有更好的方案？坐等回复，谢谢
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1楼 2014-07-24 14:34:41
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xzy0425

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-07-24 22:03:48
zhenzhen0216: 金币+2, ★有帮助 2014-07-25 15:56:17
我没做过单酶切自连或单酶切目的基因与载体连接的实验，但最近看到过这方面的一些东西，我想跟你分享一下。首先，单酶切会导致自连现象，从而影响目的基因与载体的重组。为了克服自连，往往是对载体的末端进行去除磷酸基，使用的是磷酸酶。因为链接是需要磷酸基的，去除磷酸基可以降低或者是避免自连。其次，无论是目的基因自连还是载体与目的基因链接都是需要DNA连接酶的参与，酶链体系包括：目的基因、载体、DNA连接酶、酶缓冲液和双蒸水（一般在16摄氏度下进行）。最后，你要注意目的基因自连时方向的问题或者构建重组载体时方向问题，避免方向错误。
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2楼2014-07-24 17:17:12
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zhenzhen0216

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xzy0425 at 2014-07-24 17:17:12
我没做过单酶切自连或单酶切目的基因与载体连接的实验，但最近看到过这方面的一些东西，我想跟你分享一下。首先，单酶切会导致自连现象，从而影响目的基因与载体的重组。为了克服自连，往往是对载体的末端进行去除磷 ...

谢谢，我现在是需要让片段自连，但是分析了下，随机性太大，自连的个数和方向都是问题，鉴定估计非常繁琐，暂且放下此方案了
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3楼2014-07-25 15:55:48
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