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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌株酶活突然下降
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

[求助] 菌株酶活突然下降 已有2人参与

将蛋白在大肠杆菌中进行表达，开始的时候表达量很好，酶活也很高，但是隔了一天再重新发酵，发酵条件完全一样，酶活降低了很多倍，各位虫友遇到过类似问题吗？
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1楼 2014-07-23 21:35:33
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
夏天的普洱茶(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:38:22
以下是几个方面的可能
1.你第二天重新发酵的菌的来源和第一次完全一样吗，甘油管？平板？还是第一次的菌转接的？
2.补加IPTG的时候菌体的OD值和第一次一样吗？
3.诱导后需要破碎细胞收集酶液吗？如果需要破碎，那你确定第二次破碎的成功吗？
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大家相互帮助哈
2楼2014-07-23 22:28:41
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-23 22:28:41
以下是几个方面的可能
1.你第二天重新发酵的菌的来源和第一次完全一样吗，甘油管？平板？还是第一次的菌转接的？
2.补加IPTG的时候菌体的OD值和第一次一样吗？
3.诱导后需要破碎细胞收集酶液吗？如果需要破碎，那 ...

1.第二天发酵的菌是第一天的菌在平板上划线分离得到的，我怀疑可能是这个原因，但是只传了一代，菌株不会退化的这么严重吧
2.诱导的时候OD基本一样，都在1.2左右
3.诱导后要细胞破碎，诱导时间一样，破碎条件一样，应该破碎程度一样的吧。
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3楼2014-07-24 08:49:44
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
夏天的普洱茶(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-25 08:47:10
引用回帖:
3楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2014-07-24 08:49:44
1.第二天发酵的菌是第一天的菌在平板上划线分离得到的，我怀疑可能是这个原因，但是只传了一代，菌株不会退化的这么严重吧
2.诱导的时候OD基本一样，都在1.2左右
3.诱导后要细胞破碎，诱导时间一样，破碎条件一样 ...

你第一天的菌用于划线的平板上带氨苄吗？如果没氨苄强烈建议再划一次线。那你第一次用于发酵的那个菌的单菌落还留着没有？如果还有直接用那个菌落再发酵一次，接菌前也不用划线，扎一个带氨苄的母版就可以了。如果能达到原来的水平立刻制备甘油管保存菌株。
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大家相互帮助哈
4楼2014-07-24 19:56:39
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你第二次发酵的种子液是不是在冰箱里放置过？
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
5楼2014-07-24 20:24:07
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-24 19:56:39
你第一天的菌用于划线的平板上带氨苄吗？如果没氨苄强烈建议再划一次线。那你第一次用于发酵的那个菌的单菌落还留着没有？如果还有直接用那个菌落再发酵一次，接菌前也不用划线，扎一个带氨苄的母版就可以了。如果 ...

加抗生素了，第一次的菌保留了，昨天重新发酵了一次，今天测酶活也下降了。
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6楼2014-07-24 21:52:05
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gjs713 at 2014-07-24 20:24:07
你第二次发酵的种子液是不是在冰箱里放置过？

种子液没有，我都是挑菌落活化，然后再接种发酵的
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7楼2014-07-24 21:52:35
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★
夏天的普洱茶(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-25 08:46:50
引用回帖:
7楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2014-07-24 21:52:35
种子液没有，我都是挑菌落活化，然后再接种发酵的...

这个情况我也碰到过。你就涂布平板  然后多挑几个  筛一下看看，选酶活高的。。最后如果还是不行的话，有一个笨但是却十分可行的办法，你拿质粒重新转化表达宿主，酶活肯定恢复，反正做起来也快 一天一夜
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
8楼2014-07-24 23:49:09
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gjs713 at 2014-07-24 23:49:09
这个情况我也碰到过。你就涂布平板  然后多挑几个  筛一下看看，选酶活高的。。最后如果还是不行的话，有一个笨但是却十分可行的办法，你拿质粒重新转化表达宿主，酶活肯定恢复，反正做起来也快 一天一夜...

好的，谢谢，我做诱导时间优化遇到了这种情况，超级郁闷，熬了通宵发现酶活降了很多。对于构建好的工程菌你每次发酵都是用什么接种的呢？
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9楼2014-07-25 09:29:27
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-25 13:54:56
引用回帖:
9楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2014-07-25 09:29:27
好的，谢谢，我做诱导时间优化遇到了这种情况，超级郁闷，熬了通宵发现酶活降了很多。对于构建好的工程菌你每次发酵都是用什么接种的呢？...

我的是平板 斜面 甘油管都保存。平时用甘油管用的比较多。对于工程菌 就得做多手准备。给你提个建议：你构建好的重组质粒一定要保存好，其他的都无所谓。菌种出现问题随时可以重新转化构建
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10楼2014-07-25 09:53:25
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