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bomeijuan

银虫 (小有名气)

[交流] 急a ,PCR不出现目的条带

细菌基因组DNA提取出来以后PCR,2%的琼脂糖电泳1个小时,基本都是很多很弱的条带,不出现亮的目的条带,怀疑是引物二聚体。目的片段是200bp左右。
但是DNA提出来后跑了电泳都能看到有条带的。
但是别人跟我用相同的试剂,相同的PCR程序,相同的引物都能扩出来。
请问大家这是什么原因,条件应该怎么优化?

[ Last edited by bomeijuan on 2008-4-9 at 14:44 ]
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辛雨237

铁杆木虫 (著名写手)

有杂带吗?
电泳时间太长了啊
春暖花开
2楼2008-04-05 17:06:44
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

可能是退火温度太低了,杂带太多,大家都有,但都不亮
3楼2008-04-05 17:13:34
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

2%的琼脂糖浓度太高了,一般0.8%
做个温度梯度和模板梯度试试
4楼2008-04-05 17:14:01
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

你的目的基因多大呀!是不是胶浓度太高了
5楼2008-04-05 17:14:55
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figo.339

木虫 (著名写手)

一般来讲DNA跑电泳时都是0.8%的胶的,你的胶浓度可能是太大了。
6楼2008-04-06 13:43:57
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canghai6

铁杆木虫 (正式写手)

什么样的引物二聚体也不能200bp啊
估计是出了非特异的扩增
建议把图拿出来让大家看看,这样也好分析
一般想提高特异性的话,可以提高Mg离子浓度或提高退火温度
chysx6@163.com
7楼2008-04-06 17:26:22
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bomeijuan

银虫 (小有名气)

pcr图

这就是我的图,目的片断应该在200bp左右,当然用2%的胶了。MARKER是100bp的,但是图中全是200BP以下的引物二聚体。
8楼2008-04-06 22:56:38
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bomeijuan

银虫 (小有名气)

PCR图片


这个PCR后电泳图片。解释同上,但是不需要付费了。图中的暗带和亮带都不在应该的大小范围内(目的条带应该是200bp左右)
9楼2008-04-06 23:04:45
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greenspringmi

银虫 (正式写手)

从模板浓度来入手,做个模板浓度梯度
10楼2008-04-07 09:38:06
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