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大漠雪狼

金虫 (初入文坛)

[求助] 酶切连接 已有4人参与

哪位大神知道,采用PSTⅠ酶切小片段与PSTⅠ酶切大片段连接,连了好多次都连不上,求大神指导!!!
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今天为明天而努力。
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yzj926521

新虫 (小有名气)

感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2014-06-30 20:59:33
我也是呢,双酶切连接了两个月了都还没有连进去,排除各种可能原因,试着用的其他方法都不成功,也是很苦恼
2楼2014-06-30 08:13:39
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

单酶切??这样的话会自连啊。
3楼2014-06-30 10:46:57
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55liuyan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
大漠雪狼(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-30 20:59:42
首先应该考虑的是两个片段的比例问题,然后注意一下你的连接条件,最好用最合适的温度
每日三省吾身,平静,定气
4楼2014-06-30 12:17:26
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xuanyalizi

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-06-30 23:46:19
单酶切的话考虑将载体做去磷酸化,片段磷酸化,应该可以做出来的。你说的没连上是没长转化子还是全是空载背景,这是有差别的。如果没长克隆可能是感受态的问题,如果是背景就是没连上,另外建议多挑些克隆做菌落PCR。
闲适恬淡,宠辱不惊
5楼2014-06-30 22:08:26
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-07-15 15:28:32
连接不上,你的两个片段的切口是否一致?你连接的两个片段有没有跑胶检测,有东西么?你的连接酶有没有过期,有阴阳性对照么?
6楼2014-07-01 15:59:34
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