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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切连接
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大漠雪狼

金虫 (初入文坛)

[求助] 酶切连接 已有4人参与

哪位大神知道，采用PSTⅠ酶切小片段与PSTⅠ酶切大片段连接，连了好多次都连不上，求大神指导！！！
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今天为明天而努力。
1楼 2014-06-29 23:18:47
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yzj926521

新虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2014-06-30 20:59:33
我也是呢，双酶切连接了两个月了都还没有连进去，排除各种可能原因，试着用的其他方法都不成功，也是很苦恼
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2楼2014-06-30 08:13:39
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
单酶切？？这样的话会自连啊。
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3楼2014-06-30 10:46:57
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55liuyan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
大漠雪狼(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-30 20:59:42
首先应该考虑的是两个片段的比例问题，然后注意一下你的连接条件，最好用最合适的温度
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每日三省吾身，平静，定气
4楼2014-06-30 12:17:26
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xuanyalizi

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-06-30 23:46:19
单酶切的话考虑将载体做去磷酸化，片段磷酸化，应该可以做出来的。你说的没连上是没长转化子还是全是空载背景，这是有差别的。如果没长克隆可能是感受态的问题，如果是背景就是没连上，另外建议多挑些克隆做菌落PCR。
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闲适恬淡，宠辱不惊
5楼2014-06-30 22:08:26
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 15:28:32
连接不上，你的两个片段的切口是否一致？你连接的两个片段有没有跑胶检测，有东西么？你的连接酶有没有过期，有阴阳性对照么？
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6楼2014-07-01 15:59:34
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